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人强直性脊柱炎相关基因的克隆及分析

作　者: 张莹
导　师: 初同伟
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 强直性脊柱炎表达谱芯片抑制差减杂交 cDNA文库组织差异基因 RT-PCR
分类号: R593.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景:强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种主要累及脊椎等中轴关节和肌腱、韧带骨附着点的慢性炎性疾病,可引起脊柱骨性强直甚至中轴关节的活动功能丧失,导致严重的残疾。AS在中国人群中的发病率约为0.2 %,患者多为青壮年,给患者及家庭带来沉重负担。有文献报道HLA-B27、TNF-α、白介素家族、KIR基因家族与AS关联,但AS发病的具体分子机制尚不清楚。现有的治疗措施难以获得满意的疗效,因此解析AS发病的分子机制成为有效开展AS治疗的关键。目的:应用表达谱芯片从AS患者的椎间组织中筛选组织差异表达基因,应用抑制差减杂交技术构建AS组织差异基因的消减cDNA文库,获得AS相关基因序列,为克隆基因全长进行基因功能研究奠定基础。方法:采用改良RNAiso Plus法从AS患者椎间组织中提取总RNA作为实验组,以未患AS的骨折患者椎间组织总RNA为对照组,制备实验组和对照组探针分别与表达谱芯片进行杂交。实验组和对照组芯片杂交结果扫描后进行比较,筛选出差异表达基因。以AS标本RNA为Tester,以骨折标本RNA为Driver,逆转录制备双链cDNA。RsaI酶切双链cDNA后在两组Tester两端分别连接不同接头,将带接头的Tester与Driver进行两轮消减杂交。杂交产物作为模板进行巢式PCR,扩增获得消减cDNA。消减cDNA进行T/A克隆后PCR检测排除假阳性,构建消减cDNA文库。将消减cDNA文库样本进行测序,拼接序列后获得AS组织高表达基因。结合文献分析表达谱芯片和SSH结果,选择有价值的基因作为AS候选基因,RT-PCR验证其在AS组织和骨折组织中的表达。结果:成功提取获得高质量的椎间组织总RNA,完整性和纯度达到后实验要求。表达谱芯片筛选获得237条AS组织差异基因,筛选出20条作为AS候选基因,RT-PCR检测表明其在AS组织和对照组中的表达情况与芯片结果基本一致。采用抑制差减杂交成功构建含182个差异基因片段的消减cDNA文库,测序后拼接获得32条AS候选基因,其中8条基因确定为AS相关基因,包括5条已知基因和3条未知基因。RT-PCR检测8条基因全部为在AS组织高表达的差异基因。结论:采用改良RNAiso Plus法提取椎间组织总RNA,可以有效去除蛋白多糖从获得高质量总RNA。采用表达谱芯片成功获得237个AS组织差异基因,采用抑制差减杂交成功构建消减cDNA文库。芯片结果中筛选到20条AS候选基因,RT-PCR检测表明其表达情况与芯片结果一致。SSH结果中筛选到32条AS候选基因,其中8条确定为AS相关基因,包括5条已知基因和3条未知基因, RT-PCR检测表明全部为AS组织高表达基因。

全文目录

英文缩写词一览表  4-5
英文摘要  5-7
中文摘要  7-9
前言  9-10
第一部分人强直性脊柱炎组织差异表达基因的筛选  10-33
  材料与方法  10-20
  结果  20-30
  讨论  30-33
第二部分人强直性脊柱炎组织差异表达基因的验证及分析  33-57
  材料与方法  33-35
  结果  35-53
  讨论  53-57
全文结论  57-58
致谢  58-59
文献综述强直性脊柱炎基础研究进展  59-69
  参考文献  63-69
硕士期间发表的文章  69-70
附录  70-83

人强直性脊柱炎相关基因的克隆及分析

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