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猪流行性腹泻病毒S_(△16)蛋白亲和肽的筛选与鉴定

作　者: 马晓微
导　师: 任晓峰
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒（PEDV） 稳定表达细胞系 M13多克隆抗体 噬菌体展示技术 多肽活性鉴定
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究中成功构建编码缺失16个碱基的S蛋白真核重组表达质粒pcDNA3.1-SΔ16，并将其转染BHK-21细胞，通过G418加压筛选出稳定表达SΔ16基因的细胞株，稳定表达细胞株经RT-PCR及间接免疫荧光检测证实SΔ16基因在BHK-21细胞中获得高效表达。接下来本研究将噬菌体十二肽原始文库进行大量扩增，作为免疫原制备兔抗M13的多克隆抗体血清并通过间接ELISA鉴定。结果证实该兔抗M13的多克隆抗体可与扩增噬菌体文库发生很好的抗原抗体反应，多抗效价达1:1048576。将制备的噬菌体M13多克隆抗体与商业化M13抗体水平比较，结果显示两者效果无明显差异。本研究成功制备了兔抗M13噬菌体多克隆抗体，为后续进行噬菌体生物淘选提供了重要材料。利用噬菌体十二肽库对稳定表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的BHK-21细胞共进行三轮全细胞减性筛选。从筛选后的两部分噬菌体库中，即细胞表面结合噬菌体部分和内化结合噬菌体部分，分别挑取14个噬菌体单克隆，通过phage-ELISA方法检测后，分别选取细胞表面结合部分和内化结合部分结合性较高的噬菌体单克隆各10个进行核酸序列测定及氨基酸序列的推导。通过三轮全细胞减性筛选后，最终筛选出一条表面结合噬菌体及内化结合噬菌体共有序列-AETVESCLAKSH-，并将该短肽进行人工合成。通过间接免疫荧光和实时荧光定量PCR检测合成的短肽体外抗病毒活性，结果显示猪流行性腹泻病毒与合成的短肽共同孵育1h后加入Vero-E6细胞此种作用方式对病毒有抑制作用，呈现剂量依赖性。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
1 引言  10-17
  1.1 PEDV 研究进展  10-13
    1.1.1 PED 的历史背景  10
    1.1.2 PED 的危害及流行病学  10
    1.1.3 PEDV 的分子生物学研究进展  10-13
  1.2 噬菌体展示技术的研究进展  13-16
    1.2.1 噬菌体展示技术的原理  13-14
    1.2.2 噬菌体展示技术的筛选方法  14-15
    1.2.3 噬菌体展示技术的应用  15-16
  1.3 研究的目的和意义  16-17
2 材料与方法  17-32
  2.1 试验材料  17-18
    2.1.1 质粒、工程菌、细胞株、毒株  17
    2.1.2 试验动物  17
    2.1.3 主要工具酶、试剂盒和抗体  17
    2.1.4 主要生化试剂  17
    2.1.5 实验试剂配制  17-18
    2.1.6 仪器设备  18
  2.2 试验方法  18-32
    2.2.1 PEDV S_(Δ16)蛋白真核表达载体构建及其稳定表达细胞系的建立  18-21
    2.2.2 重组质粒的鉴定  21-22
    2.2.3 稳定表达细胞株的建立  22-24
    2.2.4 M13 噬菌体多克隆抗体制备  24-25
    2.2.5 噬菌体随机十二肽库对靶分子亲和配体的生物淘选  25-27
    2.2.6 结合克隆的特征鉴定  27-29
    2.2.7 所选短肽配体共有氨基酸序列的推导及合成  29-30
    2.2.8 多肽的生物活性鉴定  30-32
3 试验结果  32-42
  3.1 S_(Δ16)蛋白真核表达载体构建及其稳定表达细胞系的建立  32-35
    3.1.1 S_(Δ16)基因的亚克隆  32
    3.1.2 重组质粒 pcDNA3.1-S_(Δ16)的鉴定  32-33
    3.1.3 BHK-21 细胞的 G418 最适工作浓度  33
    3.1.4 稳定表达 S_(Δ16)基因的 BHK-21 单克隆细胞系的筛选及鉴定  33-35
  3.2 M13 噬菌体多克隆抗体制备  35-37
    3.2.1 扩增噬菌体滴度及浓度的测定  35
    3.2.2 M13 多克隆抗血清的活性鉴定  35-37
  3.3 噬菌体十二肽库对稳定表达细胞系的生物淘选  37-42
    3.3.1 噬菌体十二肽库对靶细胞的淘选结果  37-40
    3.3.2 合成肽的生物活性检测  40-42
4 讨论  42-46
  4.1 PEDV S_(Δ16)基因真核载体表达质粒的设计与构建  42
  4.2 稳定表达 S_(Δ16)蛋白的 BHK-21 细胞系的建立与鉴定  42-43
  4.3 M13 多克隆抗体的制备  43
  4.4 PEDV S_(Δ16)亲和肽的筛选与鉴定  43-46
    4.4.1 噬菌体肽库对靶细胞 BHK-S_(Δ16)亲和肽的筛选  43-44
    4.4.2 PEDV S_(Δ16)亲和肽的鉴定与功能分析  44-46
5 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
攻读硕士期间发表的学术论文  52

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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