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基于CDR移植的高致病性禽流感病毒治疗性抗体人源化的初步研究

作　者: 郑振华
导　师: 罗文新
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: CDR移植 噬菌体展示技术 单链抗体库 治疗性抗体 H5N1
分类号: R511.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


鼠单抗13D4(13D4mAb)是本实验筛选获得的一株针对高致病性禽流感(H5N1)的广谱中和单抗,在前期研究工作中,我们已经成功地对其进行了嵌合抗体(13D4cAb)的改造。血凝抑制试验(HI)和细胞中和实验已证实13D4cAb保留了亲本鼠单抗的广谱HI活性和中和活性,动物治疗试验也表明了13D4cAb对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果。但嵌合抗体可变区中的鼠源序列仍然可以诱导人体产生HAMA,因此需要对其进一步人源化改造。本研究在13D4cAb的基础上,利用噬菌体展示技术进一步对其进行CDR移植改造。首先,选择同源性最高的人胚系基因1-69-04和1-39-01作为人源化模板;然后综合各种方法对13D4mAb可变区序列进行分析并确定骨架区上对抗体—抗原结合有影响的关键氨基酸残基,其中重链有12个,轻链有8个;利用简并引物对这些关键点进行回复突变,将人、鼠源译本同时编入人源化单链抗体库序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化单链抗体基因片段库;利用噬菌体展示技术构建人源化单链抗体库,实际库容量达到3×10~7;通过血凝素蛋白(HA1)和YU22病毒板对抗体库进行筛选,利用ELISA方法检测获得37个阳性克隆;选取16个阳性序列克隆入双启动真核表达载体Plan3,利用293FT细胞进行瞬时转染,通过血凝抑制实验(HI)检测各人源化抗体的活性及广谱性,初步确定5个具有较好HI活性和广谱性的人源化抗体,编号分别为H1126-08,H1213-21,H1202-34,H1121-37,Y1121-29;利用FLP-in系统筛选这5个人源化抗体的稳定表达细胞株并进行人源化抗体的表达和纯化;通过定量ELISA实验初步比较了这5个人源化抗体与HA1抗原的结合活性,其中H1213-21及H1202-34的活性最好,其人源化程度分别为88.9%和89.4%。总之,通过噬菌体展示技术本研究成功地对13D4cAb进行了CDR移植,获得了多个人源化抗体,他们基本上保持了13D4cAb的广谱HI活性及与HA1抗原的结合活性。这些人源化抗体将大大降低13D4用于治疗人感染H5N1时的HAMA反应,为禽流感治疗性抗体的临床应用奠定基础。同时,本文也证明了利用噬菌体展示技术进行CDR移植是一个高效,简便的方法。

全文目录


摘要  9-10
Abstract  10-12
缩略词(ABBREVIATION)  12-13
第一章 前言  13-41
  1 抗体药物的发展历史  13-17
  2 抗体的结构和作用机理  17-21
    2.1 抗体的结构  17-19
    2.2 抗体的作用机理  19-21
  3 抗体人源化  21-28
    3.1 嵌合抗体  21-23
    3.2 人源化抗体  23-28
  4 人源抗体  28-30
    4.1 抗体库展示技术  28-29
    4.2 人B细胞永生化技术  29
    4.3 转基因小鼠  29-30
  5 抗体的表达系统  30-33
    5.1 哺乳动物细胞表达系统  30-31
    5.2 大肠杆菌表达系统  31-32
    5.3 酵母表达体系  32
    5.4 植物细胞表达系统  32
    5.5 转基因动物表达系统  32-33
  6 抗体药物的应用  33-36
    6.1 在肿瘤治疗方面的应用  34
    6.2 在器官移植中的应用  34
    6.3 在自身免疫性疾病方面的应用  34-35
    6.4 在心血管疾病方面的应用  35
    6.5 在感染性疾病方面的应用  35-36
  7 高致病性禽流感  36-39
    7.1 高致病性禽流感简介  36-37
    7.2 高致病性禽流感的对策  37-38
    7.3 抗体药物用于治疗高致病性禽流感  38-39
  8 本论文研究的思路、目的和意义  39-41
第二章 材料与方法  41-65
  1 材料  41-46
    1.1 主要仪器  41-42
    1.2 主要试剂与材料  42-43
    1.3 常用溶液及培养基配制  43-46
  2 方法  46-65
    2.1 分子克隆常规操作  46-50
    2.2 细胞试验常规操作  50-51
    2.3 13D4mAb的人源化设计  51-53
    2.4 13D4人源化单链抗体库的构建  53-58
    2.5 13D4人源化单链抗体库的筛选和检测  58-59
    2.6 13D4人源化抗体序列分析  59
    2.7 13D4人源化抗体的构建  59-61
    2.8 人源化抗体的表达及纯化  61-63
    2.9 人源化抗体的鉴定  63-65
第三章 结果与分析  65-87
  1 13D4mAb人源化设计  65-71
    1.1 人源化模板的选择  65
    1.2 13D4mAb可变区序列分析  65-70
    1.3 人源化抗体回复突变点的确定  70-71
  2 13D4人源化单链抗体库的构建  71-74
    2.1 人源化单链抗体库片段的获得  71-72
    2.2 13D4人源化单链抗体库的构建  72-73
    2.3 13D4人源化单链抗体库的扩增  73-74
  3 13D4人源化单链抗体库的筛选和检测  74-78
    3.1 固相筛选用抗原板的优化  74-75
    3.2 抗体库的筛选  75-77
    3.3 抗体库检测  77-78
  4 13D4人源化抗体序列分析  78-81
  5 13D4人源化抗体表达载体的构建  81-82
  6 人源化抗体的表达及鉴定  82-87
    6.1 人源化抗体的瞬时表达和广谱HI活性测定  82-83
    6.2 稳定细胞株的筛选和人源化抗体的表达  83-84
    6.3 抗体的纯化  84-85
    6.4 人源化抗体与抗原结合能力的检测  85-87
第四章 讨论  87-94
  1 13D4cAb的人源化设计  87-88
  2 人源化单链抗体库的构建和筛选  88-91
  3 抗体的表达  91-92
  4 人源化抗体的活性检测  92-94
第五章 小结与展望  94-96
参考文献  96-107
致谢  107-108
附录  108

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 流行性感冒
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