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内毒素诱导的内皮细胞特异性结合肽的筛选及生物信息分析

作　者: 牛茂昌
导　师: 姜勇；李玉花
学　校: 东北林业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 内毒素噬菌体展示技术随机肽库人脐静脉内皮细胞生物信息学
分类号: R459.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

脓毒症是指各种致病微生物或其毒素引起的全身炎症反应综合征,是严重感染、创伤、休克、大手术后等临床危重患者死亡的主要原因。其发病机制非常复杂,涉及多种细胞感染、炎症、免疫功能紊乱、凝血功能障碍及组织损害等一系列问题。脓毒症进一步可发展成脓毒性休克和多器官功能障碍综合征后,治疗更困难、预后很恶劣。内毒素(endotoxin)是引起脓毒症的主要因素,其化学本质为脂多糖(LPS)。在全身炎症反应综合征及脓毒症发病机制的研究中,目前较为公认的是“二级炎症反应理论”:LPS首先诱发单核巨噬细胞产生多种炎症介质,后者进一步激活单核巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等多种效应细胞,并形成瀑布效应,使炎症反应扩大甚至失去控制,最终导致以细胞自身破坏为特征的全身性炎症反应。在炎症反应过程中,LPS激活内皮细胞,进而使凝血和纤溶系统的级联反应激活,并通过粒细胞和内皮组织相互作用,促进微循环障碍恶化。因此,在炎症反应过程中对内皮细胞进行深入研究和有效干预,则有望减轻炎症级联反应。内皮细胞在受到LPS诱导刺激后,自身的结构和功能发生改变,导致细胞表面一些与炎症相关的分子表达增多或暴露其相应的活性结构部位。与正常内皮细胞相比,受刺激的细胞表面存在着数量或/和结构上具有差异的分子,这些分子可能是炎症级联反应时某些重要炎症介质的结合位点,寻找到这些差异分子的特异性结合肽,则有可能通过竞争性抑制相应炎症介质与效应细胞的结合,进而中和或阻断这些炎症介质的生物学效应,达到阻断或减轻全身性炎症反应的发生。细胞是一个复杂的生物体系,表面分布着大量的信号分子,可反映细胞的特性及所处的功能状态。虽然可将这些分子纯化作为靶标来筛选细胞特异性的结合肽,但纯化这些分子相当困难。而完整细胞筛选不需事先知道有关受体的信息,对某种特定状态下细胞膜表面差异分子的筛选非常有利,既可保持细胞表面表达的受体的完整构象和生物学活性,又能充分模拟自然条件下蛋白质分子间的相互作用,从而有效寻找到特异性结合于细胞表面的标志蛋白和鉴定细胞特异标志。但是,由于完整细胞的膜表面抗原密度很低,给抗体筛选带来了一定难度,也存在非特异性大、背景值高、洗涤过程中特异性配体损失等不利因素,很难获得针对某一抗原的单链抗体。噬菌体展示技术就为我们寻找这些差异分子的特异性结合肽提供了有效的技术手段。为了解决上述问题,并尽可能接近体内环境,我们选用Giordano等新建立的用于细胞差减筛选的“生物淘筛和对筛选出的反应配体的快速分析(BRASIL)”技术,顺利地完成了本课题的筛选工作。在分析这些特异性结合肽的同时,成功地建立了一套完整、可靠的生物信息学分析方法,并建立了生物信息学网络分析平台(http://phdpap.fimmu.com)。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 绪论  8-10
2 噬菌体展示技术筛选材料与方法  10-27
  2.1 材料  10-12
    2.1.1 主要试剂  10
    2.1.2 肽库与脐带来源  10-11
    2.1.3 主要仪器  11
    2.1.4 试剂配制  11-12
  2.2 方法  12-16
    2.2.1 HUVEC原代培养  12-13
    2.2.2 HUVEC Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧光鉴定方法  13
    2.2.3 Ph.D.-C7C噬菌体环七肽库的滴度测定  13-14
    2.2.4 PEG/NaCl二次沉淀法纯化噬菌体扩增液  14
    2.2.5 BRASIL法筛选噬菌体环七肽库  14-15
    2.2.6 噬菌体DNA的提取及纯化  15
    2.2.7 PCR扩增含插入目的片段的噬菌体DNA  15
    2.2.8 噬菌体DNA序列测定及氨基酸序列推导  15-16
  2.3 结果  16-21
    2.3.1 HUVEC原代培养与鉴定结果  16
    2.3.2 Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库的库容量测定结果  16
    2.3.3 噬菌体肽库的筛选及富集效果分析  16-17
    2.3.4 噬菌体DNA电泳鉴定结果  17
    2.3.5 PCR产物电泳鉴定结果  17
    2.3.6 PCR产物DNA测序结果及氨基酸序列推导  17-21
  2.4 讨论  21-25
  2.5 小结  25-27
3 噬菌体展示肽的生物信息学分析平台建立及分析  27-50
  3.1 材料  27-32
    3.1.1 计算机信息处理软件和硬件  27-28
    3.1.2 序列数据和数据库  28-29
    3.1.3 蛋白质序列分析软件  29-32
  3.2 方法  32-34
    3.2.1 噬菌体展示七肽序列的去冗余分析  32
    3.2.2 三肽残基的计算及显著性分析  32-33
    3.2.3 特征性短肽残基的分析  33
    3.2.4 包含特征性短肽的人类蛋白的分析  33
    3.2.5 分泌蛋白的预测分析  33-34
    3.2.6 跨膜蛋白的预测分析  34
  3.3 结果  34-43
    3.3.1 三肽计算及丰度统计  34-35
    3.3.2 三肽的显著性分析  35
    3.3.3 特征性短肽基序的获得  35
    3.3.4 候选验证噬菌体克隆的分析结果  35-36
    3.3.5 包含特征性短肽的人类蛋白的分析结果  36-37
    3.3.6 分泌蛋白的预测分析结果  37-40
    3.3.7 跨膜蛋白的预测分析结果  40-42
    3.3.8 功能蛋白及相应短肽基序的分析结果  42-43
  3.4 讨论  43-48
    3.4.1 生物信息学的发展及其重要性  43-44
    3.4.2 泊松分布检验在本研究中的应用  44
    3.4.3 短肽序列的同源性分析  44-45
    3.4.4 候选验证噬菌体克隆的再筛选  45
    3.4.5 序列相似性比较分析  45-46
    3.4.6 功能蛋白表位模拟肽的分析  46-48
    3.4.7 功能蛋白表位模拟肽的分析  48
  3.5 小结  48-50
结论与讨论  50-51
参考文献  51-55
附录  55-56
攻读学位期间发表的学术论文  56-57
致谢  57-58

内毒素诱导的内皮细胞特异性结合肽的筛选及生物信息分析

内容摘要

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