学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

IBDV VP1单克隆抗体的制备和稳定表达Vero E6细胞系的建立

作　者: 李俊山
导　师: 魏萍
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性法氏囊病病毒 VP1 原核表达 单克隆抗体 真核表达 稳定表达细胞系
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 129次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是危害世界养禽业的主要传染病之一，其病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，导致免疫抑制。VP1是一种依赖RNA的RNA聚合酶，与IBDV的复制效率和毒力的关系日趋成为研究IBDV的热点。笔者现有资料，国内关于IBDV VP1的表达、单克隆抗体的制备和稳定表达VP1细胞系的建立尚未见报道。本研究的目的之一是构建IBDV VP1基因的原核表达载体，以原核表达的VP1蛋白为免疫原制备特异性单克隆抗体，制备的单克隆抗体可以为下一步建立细胞系提供检测的物质条件；目的之二构建IBDV VP1基因的真核表达载体，建立稳定表达VP1蛋白的Vero E6细胞系，为深入研究VP1与病毒复制和毒力的关系奠定基础。本课题主要研究内容包括以下几方面：1．IBDV VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备从已构建含有IBDV Gt株B节段的质粒中扩增出VP1基因，将其克隆到表达载体pET32a。转化感受态细胞E.coli DH5α，获得重组阳性质粒pET32a-VP1。将pET32a-VP1转化宿主菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下成功表达了约115 ku的VP1融合蛋白，并以包涵体形式存在。用电泳法纯化蛋白并免疫BALB/c小鼠，制备了多克隆抗体。Western blot分析表明，纯化的蛋白能够被抗His单克隆抗体和IBDV阳性血清识别。ELISA分析表明，制备的融合蛋白抗血清效价在1：12800以上。间接免疫试验表明，多克隆抗体能与自然结构的IBDV发生特异性反应。2．IBDV VP1单克隆抗体的制备与鉴定取上面免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞常规融合，依次进行HAT选择培养，间接ELISA法筛选阳性克隆，有限稀释法进行单克隆化。获得了C4、D4两株能稳定分泌抗IBDVVP1的杂交瘤细胞株，并对C4、D4进行了稳定性、特异性方面的鉴定。腹水的效价分别为1×10~5和1×10~2，IgG亚类鉴定均为IgG1。3．稳定表达IBDV VP1的Vero E6细胞系的建立将IBDV Gt株的VP1基因分别克隆到真核表达载体pCI-neo和pEGFP-N1，获得真核表达质粒pCI-neo／VP1和pEGFP-N1／VP1。在脂质体介导下，将其导入Vero E6细胞，进行瞬时表达分析。经G418筛选后得到稳定转染细胞株，用有限稀释法获取亚克隆细胞株。然后通过间接免疫荧光和RT-PCR检测VP1基因在Vero E6细胞中的稳定表达情况。经过RT-PCR检测到该细胞中有VP1 mRNA的表达，用间接免疫荧光法可以在稳定转染质粒pCI-neo／VP1的Vero E6细胞上检测到较强的绿色荧光，证实Vero E6细胞内有VP1蛋白的表达。获得了稳定表达VP1蛋白的Vero E6细胞系。

全文目录


中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-19
  1.1 病原学  11
  1.2 IBDV的基因组结构和编码的蛋白  11-13
  1.3 IBD流行病学  13
  1.4 IBDV抗原与毒力变异的分子基础  13-14
  1.5 IBD的防制  14
  1.6 IBDV的VP1基因(RdRp)研究进展  14-17
  1.7 研究的背景、目的和意义  17-19
2 材料与方法  19-30
  2.1 试验材料  19-21
    2.1.1 病毒、细胞和实验动物  19
    2.1.2 菌株、质粒和表达载体  19-20
    2.1.3 主要试剂  20
    2.1.4 主要仪器设备  20-21
    2.1.5 引物  21
  2.2 实验方法  21-30
    2.2.1 IBDV VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备  21-23
    2.2.2 IBDV VP1单克隆抗体的制备与鉴定  23-27
    2.2.3 稳定表达IBDV VP1的Vero E6细胞系的建立  27-30
3 结果与分析  30-40
  3.1 IBDV VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备  30-33
    3.1.1 原核表达载体的构建和鉴定  30
    3.1.2 表达产物SDS-PAGE电泳分析  30-31
    3.1.3 Western blot分析  31-32
    3.1.4 鼠抗VP1蛋白多克隆抗体的制备和鉴定  32-33
    3.1.5 鼠抗VP1蛋白多克隆抗体的效价测定和间接免疫荧光试验  33
  3.2 VP1单克隆抗体的制备与鉴定  33-36
    3.2.1 重组蛋白pET32a-VP1包被ELISA方法最佳工作条件的建立  33-34
    3.2.2 细胞融合率与阳性率的计算  34
    3.2.3 单克隆抗体的筛选与单克隆杂交瘤细胞株的建立  34
    3.2.4 单克隆抗体效价的测定  34-35
    3.2.5 单克隆抗体亚类鉴定  35
    3.2.6 染色体分析  35
    3.2.7 杂交瘤细胞稳定性分析  35
    3.2.8 间接免疫荧光实验  35-36
    3.2.9 Western blot分析  36
  3.3 稳定表达IBDV VP1的Vero E6细胞系的建立  36-40
    3.3.1 重组质粒pCI-neo/VP1和pEGFP-N1/VP1的鉴定  36-37
    3.3.2 G418工作浓度的确定  37
    3.3.3 G418筛选Vero E6细胞的阳性克隆  37
    3.3.4 pEGFP-N1/VP1的EGFP表达检测  37-38
    3.3.5 pCI-neo/VP1的间接免疫荧光表达分析  38-39
    3.3.6 RT-PCR检测稳定转染细胞的mRNA  39-40
4 讨论  40-43
  4.1 IBOV VP1原核表达载体的构建与诱导表达  40
  4.2 免疫原的制备与免疫佐剂的选择  40-41
  4.3 细胞的融合及单克隆细胞株筛选  41
  4.4 真核表达载体的选择和G481的选择培养  41-42
  4.5 细胞系的细胞克隆和基因整合  42-43
5 结论  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-49
攻读硕士学位期间发表的学术论文  49

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  5. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  6. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  7. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  8. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  9. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  10. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  11. 猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及猪α干扰素的真核表达,S858.28
  12. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  13. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  14. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  15. 多个猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体的分子生物学特征,S828
  16. H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其AC-ELISA检测方法的建立,S855.3
  17. 抗重金属汞、铜、锌单抗可变区序列的克隆鉴定、真核表达及三维模拟,X171.5
  18. 兔源支气管败血波氏杆菌PRN蛋白的表达及其免疫保护性研究,S855.12
  19. IHHN、TS的流行病学调查和TSV结构蛋白VP1、VP3相互作用的研究,S945
  20. 新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）抗寒相关基因的分子克隆及表达分析,S793.9
  21. 草鱼NCCRP-1和IL-10基因的克隆和表达,S917.4

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
© 2012 www.xueweilunwen.com