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抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

作　者: 汪治华
导　师: 张国成；许东亮；孙新
学　校: 第四军医大学
专　业: 儿科学
关键词: 抗体库噬菌体展示技术 Fab抗体呼吸道合胞病毒呼吸道感染儿童
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

【背景】呼吸道病毒感染是儿科常见的疾病,主要包括呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腺病毒(ADV)、流感病毒A和B型( IV-A, IV-B)、副流感病毒(PIV)、人类偏肺病毒(hMPV)等,其中RSV是最常见的引起小儿呼吸道感染的病毒,90%在2岁前均感染过RSV,严重影响儿童的健康。对RSV感染的诊断、治疗和预防一直为儿科学界所关注,但直到目前为止尚无理想的抗病毒药物及有效的RSV疫苗。1891年,Emil von Behring首次将来自动物的白喉抗毒素血清用于白喉感染患儿的治疗,取得较为满意的疗效,从而在医学史上开创了抗体治疗感染性疾病的先河。1975年,杂交瘤单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)技术的创立,促进了儿科学等众多学科的迅猛发展,在临床医学中,McAb被广泛地应用于感染、肿瘤等疾病的诊断、治疗和预防,显示出良好的应用前景;但美中不足的是,这种鼠源性的单克隆抗体用于人体会产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA),它不仅使治疗用McAb迅速失去效用,甚至会引起严重的过敏反应等副作用,使其临床应用受到很大限制,因此,将鼠源性McAb人源化以及研制全人源性抗体成为各国科学家一直以来追求的目标。随着分子生物学和免疫学的发展,噬菌体抗体库技术的出现,为各种不同免疫原人源性抗体的制备提供了新途径,使人源性抗体的制备成为可能。【目的】本研究旨在利用基因重组技术及噬菌体展示技术,构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者免疫噬菌体抗体库,从该抗体库中筛选出抗呼吸道合胞病毒的人源性单克隆抗体,并对其生物学活性作进一步的研究,从而搭建人源性抗体制备的技术平台,为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效手段。【方法】抽取52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周静脉血各2 ml,共约100 ml,用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞,用异硫氰酸胍/苯酚法提取总RNA,以其为模板逆转录为cDNA。再以cDNA为模板,用PCR方法扩增出多样性抗体κ轻链基因和抗体重链Fd段基因(Fd段基因由重链的可变区和第一恒定区基因组成)。κ轻链基因的扩增产物经Sac I + Xba I双酶切后回收,用T4DNA连接酶将与经同样酶切回收的pComb3x载体片段相连接,并电转化E.coli XL1-Blue感受态菌,构建成κ轻链基因库,将转化菌液扩大培养后提取质粒,经Spe I + Xho I双酶切,回收带有多样性κ轻链基因的载体大片段与经同样双酶切后回收的Fd段重链基因片段相连接,电转化感受态E.coli XL1-Blue,构建成Fab抗体基因文库。分别用限制性核酸内切酶Sac I + Xba I及Spe I + Xho I组合双酶切鉴定κ轻链抗体基因文库和Fab噬菌体抗体基因文库的重组率。用辅助噬菌体M13K07超感染转化后的宿主菌XL1-Blue,构建成Fab噬菌体抗体库,并用亲和富集筛选技术对其进行初步筛选鉴定。【结果】用异硫氰酸胍/苯酚法提取出质量较好的总RNA,通过RT-PCR扩增出多样性κ轻链基因和重链Fd段基因,并经PCR鉴定,为所需的目的片段。最后成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体Fab抗体库,此抗体库中共含有2.6×106个克隆,用限制性内切酶酶切鉴定,其中70%均含有κ轻链基因和重链Fd段基因,所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106,其滴度约为1.06×1012pfu/ml,并经初步筛选,抗体库得到了不同程度的富集。为进一步利用亲和富集筛选技术,获得人源性抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体并对其免疫活性研究打下了良好的基础。【结论】利用DNA重组技术和噬菌体展示技术,为成功构建人源性单克隆抗体创造了良好的条件,为研制安全有效的诊断、治疗和预防小儿呼吸道合胞病毒感染的基因工程药物奠定了基础。

全文目录

缩略语表  5-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-15
文献回顾  15-31
正文  31-53
  材料和方法  31-43
    1 材料  31-34
    2 方法  34-43
  结果  43-47
  讨论  47-53
小结  53-54
参考文献  54-64
个人简历和研究成果  64-65
致谢  65

抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

内容摘要

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