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黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库的构建及在基因组研究中的应用

作　者: 耿波
导　师: 欧阳红生
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黑龙江野鲤 细菌人工染色体(BAC) 基因组文库 两步三维PCR 超级池
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 323次
引　用: 3次
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内容摘要


鲤鱼作为基因组最大的鱼类,在进化上具有重要的研究价值。目前国内外尚未开展对鲤鱼整个基因组的研究。本研究构建了鲤鱼的BAC文库,并建立了2步3维PCR、荧光原位杂交技术和染色体显微切割技术等BAC文库筛选和基因组分析方法。为开展鲤鱼基因组、功能基因组及蛋白质组研究建立了基础。本研究通过采集黑龙江野鲤全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量(HMW)DNA。为产生大小比较集中的片段,进行了BamHⅠ酶切反应最佳酶浓度梯度预试验,选择出最佳酶切反应条件,并进行两次片段选择。利用BamHⅠ酶切和PFGE电泳分离选择获得100-300kb的DNA片段,用电洗脱的方法将DNA片段从琼脂糖凝胶上洗脱下来并且使用PEG8000透析对产物进行了浓缩和纯化。克隆载体为pEZ BAC,大小为7.2kb。首次构建了黑龙江野鲤的BAC文库,该库含有46,656个克隆,插入片段大小在50-300kb之间,平均大小在100kb左右,覆盖鲤鱼全基因组2.45倍。获得的BAC克隆,保存在378块96孔板和27块384孔板中。使用8对引物(8种基因)对黑龙江野鲤BAC基因组文库进行筛选。构建了27个超级池,采用2步3维PCR方法,直接进行菌液PCR和转化成菌落PCR,实验证明将菌液转化成菌落后进行PCR初步筛选是可行的,并且证明所构建的专用于调取基因的BAC文库能够用于筛选基因。同时建立了高效稳定的2步3维PCR筛选黑龙江野鲤BAC文库的方法。本实验还对荧光原位杂交的过程进行了摸索和完善,同时对染色体的端粒进行染色体显微切割,通过二次PCR扩增,获得了清晰的条带。构建了鲤鱼的血细胞培养制备染色体方法、鲤鱼的荧光原位杂交技术和染色体显微切割技术,为今后进一步进行鲤鱼的功能基因定位及染色体步行、BAC-FISH等研究工作打下重要的基础。

全文目录


内容提要  5-6
英文缩略语  6-11
第一篇 文献综述  11-61
  第一章 基因组计划  13-23
    1 什么是基因与基因组计划  13-14
    2 基因组计划的内容  14-17
      2.1 建立遗传图谱  14-16
      2.2 建立物理图谱  16
      2.3 DNA 序列测定  16-17
      2.4 基因的确定和分析  17
    3 人类基因组研究的基本思路  17-23
      3.1 “Tackle all the chromosome at once”  17-18
      3.2 大片段外源DNA 克隆体系  18
      3.3 确定特定的基因  18-21
      3.4 利用染色体特征研究人类基因组  21-23
  第二章 鲤鱼基因组研究的重要性  23-31
    1 鲤鱼的基因组研究现状  23-26
    2 性状基因的定位  26-29
    3 鲤鱼的遗传连锁图谱  29-31
  第三章 BAC文库及其在基因组学中的应用  31-61
    1 大片段克隆载体  31-38
      1.1 粘粒（cosmid）  32-33
      1.2 酵母人工染色体（YAC）  33
      1.3 细菌人工染色体（BAC）  33-34
      1.4 双元细菌人工染色体（BIBAC）  34
      1.5 P1 克隆系统和源于P1 的人工染色体（PAC）  34-35
      1.6 可转化人工染色体（TAC）  35-36
      1.7 多基因转化载体系统  36-38
    2 BAC 载体的发展历史  38-42
    3 BAC 文库构建方法  42-46
      3.1 细菌人工染色体结构  42-45
      3.2 细菌人工染色体基因组文库的构建方法  45-46
    4 BAC 文库的鉴定  46-48
      4.1 BAC 克隆的鉴定  46-47
      4.2 BAC 克隆稳定性的鉴定  47
      4.3 检查DNA 文库是否含有细胞DNA 的污染  47
      4.4 BAC 文库的筛选  47-48
    5 BAC 克隆的常用分析方法  48-49
    6 BAC 末端测序  49-52
      6.1 BAC 末端测序  49
      6.2 末端测序的功能  49-50
      6.3 BAC 末端分离的方法  50-52
    7 BAC 文库的分类  52
    8 细菌人工染色体BAC 基因组文库的应用  52-57
    9 BAC 文库目前国内外研究现状  57-61
第二篇 研究内容  61-113
  实验一 黑龙江野鲤BAC 文库的构建  61-83
    1 材料和方法  61-72
      1.1 材料  61-65
      1.2 方法  65-72
    2 结果  72-79
      2.1 高分子量HMW DNA 的提取  72-73
      2.2 酶切条件的摸索  73-76
      2.3 酶切产物的电洗脱结果  76
      2.4 连接反应  76-78
      2.5 电转化条件的摸索和优化  78-79
      2.6 BAC 库的保存和鉴定结果  79
    3 讨论  79-82
    4 小结  82-83
  实验二 三维PCR 法从BAC 库中调取功能基因  83-103
    1 材料和方法  83-94
      1.1 材料  83-86
      1.2 实验方法  86-94
    2 结果  94-101
      2.1 BAC 文库超级池和三维筛选池的构建  94-97
      2.2 引物的筛选  97-98
      2.3 三维PCR 法筛选功能基因  98-101
    3 讨论  101-102
    4 小结  102-103
  实验三 BAC基因组文库功能基因定位技术探索  103-113
    1 材料和方法  103-107
      1.1 材料  103-104
      1.2 方法  104-107
    2 结果  107-110
      2.1 染色体的制备  108
      2.2 FISH 条件的摸索  108-110
      2.3 染色体显微切割条件的摸索  110
    3 讨论  110-112
    4 小结  112-113
结论  113-115
参考文献  115-131
附录  131-137
攻博期间发表的学术论文及其它成果  137-138
中文摘要  138-142
英文摘要  142-147
致谢  147-149
导师简介  149-150
CURRICULUM VITAE  150

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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