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厦门地区近海温泉嗜热菌的分离、鉴定以及四株来源不同嗜酸氧化亚铁硫杆菌的比较研究

作　者: 杨波
导　师: 陈新华
学　校: 国家海洋局第三海洋研究所
专　业: 海洋分子生物学
关键词: 嗜热菌嗜酸热细菌分离鉴定氧化亚铁硫杆菌基因组文库
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

微生物是地球上最大的生物资源宝库，嗜热微生物和嗜酸微生物作为其中的重要组成部分，由于生长环境的极端特殊性，使得他们具有独特的酶系统和防御机制来适应这种对大多数生物难以生存的环境。他们的细胞和酶蛋白独特的性质和与之相适应的分子结构，使之成为人们开发利用的重要生物资源，从中分离和提取的新颖工业酶和其他生物活性物质在基因工程、蛋白质工程、发酵工程及矿产资源的开发利用上均有很大的应用价值。厦门温泉是近海温泉，具有与内陆温泉和深海热液口不同的特点。本文从厦门地区近海温泉采集得到样品，共培养分离到308株嗜热菌和20株嗜酸热细菌。由于传统上微生物主要依靠培养和生化等表型特征进行分类鉴定，较为繁琐。为了从大量的菌株中筛选出不同的菌株，有效的简化筛选过程，我们采用细菌全蛋白SDS-PAGE电泳比较分析与16S rRNA基因序列比对分析相结合的方法，将分离到的嗜热菌鉴定为海洋红嗜热盐菌（Rhodothermus marinus）、嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）、水生栖热菌（Thermus scotoductus）、嗜热脂肪泥土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）、泥土芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans）、类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）和uncultured gamma proteobacterium等七种嗜热菌株，将嗜酸热细菌鉴定为酸土环脂芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）、嗜酸硫化杆菌（Sulfobacillus acidophilus）和热氧化硫化杆菌（Sulfobacillus thermosulfidooxidans）。三株嗜酸热细菌均是从中洲温泉分离得到，中洲温泉除了含有富含硫、磷等矿物质的咸水外，还有Fe²⁺离子以及其他无机元素、金属离子等，酸土环脂芽孢杆菌的分离很可能与该位点的受污染情况相关。进而得出厦门地区近海温泉样品中的微生物生长类群信息，并发现了某些可能的新菌群，有助于了解该地区近海温泉特有环境下的可培养的微生物群落类型，为了解厦门地区的生态环境和开发新的生物资源提供依据。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A．F）是硫杆菌属的一种化能自养菌，嗜酸、专性好氧，革兰氏阴性，以Fe²⁺和硫为其能源物质，是生物湿法冶金过程中的主要浸矿菌种。A．F菌能量代谢途径复杂多样，有亚铁氧化系统和硫氧化系统两套电子传递途径。本实验采用亚铁氧化速率测定、全蛋白电泳比较、基因克隆、HPLC、电镜观察、DNA-DNA杂交等方法将从4种来源不同的样品中分离到的4株A．F菌株与标准菌株ATCC23270进行比较研究，发现A．F．2菌株在亚铁氧化速率、蛋白质组成、G+Cmol％、基因组成等方面与其它A．F菌株存在明显差异，证实A．F．2菌株存在不同于其它A．F菌的亚铁氧化系统。为了从基因水平上研究A．F．2菌株对Fe²⁺的代谢过程，我们构建了A．F．2菌的基因组cosmid文库，获得了至少1500个克隆子，每个克隆子外源插入片断平均达到了35Kb以上，并利用菌落原位杂交的方法得到了包含A．F．2的Iro基因的阳性克隆，进一步的测序结果及分析仍在进行整理当中。为寻找该菌株的功能基因和亚铁氧化系统中电子传递链的相关基因及其生长适应机制等方面的研究提供了丰富的材料，有助于更好的了解A．F的遗传系统，得到活力最强以及工业应用价值最大的菌株。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-24
  1 原核微生物的鉴定与分类  11-15
  2 嗜热菌的研究进展  15-18
  3 嗜酸热细菌的研究进展  18-20
  4 嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)的研究进展  20-22
  5 本论文研究目的及意义  22-24
材料与方法  24-50
  1 实验材料和设备  24-34
  2 基本方法  34-40
  3 厦门地区近海温泉嗜热菌和嗜酸热细菌的分离与鉴定  40-43
  4 四株来源不同的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.F)的特性比较研究  43-50
结果与讨论  50-84
  第一部分厦门地区近海温泉嗜热菌和嗜酸热细菌的分离鉴定  50-67
    1 采样地点环境描述  50
    2 嗜热菌的分离与筛选  50-60
      2.1 嗜热菌的培养分离与观察  50-51
      2.2 嗜热菌的SDS-PAGE初步鉴定  51
      2.3 嗜热菌的鉴定与系统发育分析  51-54
      2.4 嗜热菌的革兰氏染色  54
      2.5 极端嗜热菌不同温度下生长曲线的测量以及生长代时的计算  54-55
      2.6 极端嗜热菌的电镜观察  55-56
      2.7 G+C mol%含量的测定  56
      2.8 厦门地区近海温泉可培养高温菌的特征描述  56-57
      2.9 讨论及分析  57-60
    3 嗜酸热细菌的分离与筛选  60-67
      3.1 嗜酸热细菌的培养分离与观察  60
      3.2 嗜酸热细菌的SDS-PAGE初步鉴定  60-61
      3.3 嗜酸热细菌的鉴定与系统发育分析  61-62
      3.4 嗜酸热细菌的革兰氏染色  62
      3.5 嗜酸热细菌最适生长pH值和最适生长温度的测定  62-63
      3.6 嗜酸热细菌的代谢初步研究  63-64
      3.7 极端嗜热菌的电镜观察  64
      3.8 G+C mol%含量的测定  64-65
      3.9 厦门地区近海温泉可培养嗜酸热细菌的特征描述  65
      3.10 讨论及分析  65-67
  第二部分四株来源不同的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.F)的生长特性比较研究  67-84
    1 最适生长条件下A.F菌的亚铁氧化速率的测定  67
    2 四株嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.F)全蛋白的比较分析  67-68
    3 四株嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.F)16SrRNA基因和亚铁氧化还原电子传递链相关基因的序列的扩增和分析  68-72
    4 电镜观察氧化亚铁硫杆菌(A.F)  72-74
    5 A.F菌G+Cmol%含量的测定  74
    6 DNA-DNA杂交分析  74-76
    7 A.F.2细菌DNA文库的构建和评估  76-80
      7.1 A.F.2细菌基因组文库构建  76-78
      7.2 A.F.2细菌基因组文库评估  78-79
      7.3 Iro基因上下游序列的测定及分析  79-80
    8 讨论与分析  80-84
      8.1 A.F.2表型和基因型的特殊性  80-81
      8.2 A.F菌的Fe~(2+)氧化机理  81-82
      8.3 A.F.2细菌基因组Cosmid文库的构建和初步研究  82
      8.4 A.F菌中的亚铁氧化酶基因  82
      8.5 A.F菌的应用制约性和解决方法  82-84
小结与展望  84-85
参考文献  85-92
附录  92-93
硕士期间发表和待发表的论文  93-94
致谢  94

厦门地区近海温泉嗜热菌的分离、鉴定以及四株来源不同嗜酸氧化亚铁硫杆菌的比较研究

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