学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

柿树炭疽菌基因组文库构建及致病性相关突变体的筛选分析

作　者: 孙虎
导　师: 徐同；张敬泽
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柿树炭疽菌 Cosmid 基因组文库 ATMT T-DNA 转化 转化子 突变体 TAIL-PCR 反向PCR
分类号: S436.65
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 462次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


柿树炭疽病(Persimmon anthracnose)是由胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides Penz．)侵染造成的，在全世界产柿国家均有发生。近年来，随着浙江省淳安地区无核柿(Diospyros kaki cv．Wuheshi)的大面积栽种，柿树炭疽病趋于严重。本实验室已对病原菌、发病规律、致病机理及与寄主互作机制进行了系统研究，然而，许多工作仅局限在细胞学水平上。利用分子生物学技术分离和鉴定柿树炭疽菌的致病相关基因，是了解柿树炭疽菌致病机理及互作机制的重要手段，不仅在植物病理学上有重要意义，而且也为生产上进一步探索新的防病途径提供线索。因此，本文采用SuperCos1载体构建了基因组文库，同时用(Agrobacterium tumefaciens mediated-transformation)ATMT技术进行了柿树炭疽菌的转化，并对致病性相关的基因进行了克隆。1基因组文库构建采用SuperCos1载体构建了胶孢炭疽菌基因组文库。建立了SDS及蛋白酶K提取高质量基因组DNA的方法，酶切可获得大小约40 kb DNA片段。片段被连接和包装后，转染XL1-Blue MR细菌，最终获得4．0×10~4个粘粒克隆(每微克基因组DNA约产生10~5个粘粒克隆)。它们混合在15％甘油中，保存于-70℃条件下。通过对50个随机重组子分析表明，98％的重组子克隆中含有外源DNA片段，平均大小为40．5 kb。按照胶孢炭疽菌基基因组DNA为50 Mb计算，库容量已高达31．75，理论上从该文库中筛选到任一DNA序列的精确概率高达99．9％。对扩增保存后文库菌液滴度测定显示，该文库滴度约为4．6×10~8 cfu／ml。当进行3次反复冻融后，其滴度仍可达4．0×10~8 cfu／ml。以上结果表明，构建的粘粒基因组文库质量比较高，符合筛选目的基因的要求。2农杆菌介导的柿树炭疽菌转化及突变体筛选本试验中，首先将构建的双元载体pATMT1通过电转化法导入农杆菌AGL-1中，然后AGL-1菌液与800μl的1×10~6／ml柿树炭疽菌TSG001分生孢子在乙酰丁香酮(AS)的培养基上共培养。经过两轮hyg抗性筛选后共获得787个转化子，转化效率高达900转化子／10~6个分生孢子。对随机挑选的14个转化子进行PCR验证表明，含有T-DNA的转化子比率达92．8％。通过表型分析，筛选出22个生长速度变异的转化子，30个菌落颜色变化的转化子，32个产孢能力减弱的转化子和18个孢子形态变异的转化子。通过致病性试验测定，获得5个弱致病性和6个无致病性转化子。3无致病性突变体分析生物学特性分析进一步对6个无致病性突变体进行分析，Cg-10、Cg-32、Cg-305、Cg-573、Cg-608和Cg-613与野生型TSG001生长速度均存在显著性差异，在菌落形态及颜色方面也存在较为明显的变异。6个转化子中，产孢量均显著低于TSG001菌株(187．5×10~6孢子／皿)，其中，Cg-10、Cg-32、Cg-305和Cg-608产孢量均不到野生型产孢量的1／100；同时6个转化子分生孢子形态之间也存在较大差异。除Cg-608孢子萌发率(80％)及附着孢形成率(75％)与野生型TSG001无显著差异外，其余5个突变体均显著低于野生型。其中，Cg-32及Cg-613的分生孢子萌发率仅为2％，Cg-613附着孢形成率更是仅为1％，而突变体Cg-32在整个孢子萌发试验中未见任何附着孢产生。T-DNA插入拷贝数鉴定Southern杂交结果显示，突变体Cg-305为3拷贝突变体，Cg-608为双拷贝突变体，其它4个突变体Cg-10、Cg-32、Cg-573、Cg-613均为T-DNA单拷贝插入。单拷贝无致病性突变体侧翼序列分析根据T-DNA插入序列设计引物，采用反向PCR、TAIL-PCR及高效TAIL-PCR扩增出Cg-10和Cg-32的左右臂侧翼序列及Cg-613的右臂侧翼序列。通过序列编辑并进行Blastn搜索，结果表明，三个无致病性突变体Cg-10、Cg-32和Cg-613 T-DNA插入位点侧翼序列分别与24-C甲基转移酶、核糖体蛋白S11和真核翻译起始因子3三个致病性相关基因具有较高同源性。

全文目录


致谢  4-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章 文献综述  12-34
  1 柿树炭疽菌及其侵染策略  12-17
    1.1 柿树炭疽病及其病原菌  12-13
    1.2 炭疽菌侵染策略  13-14
    1.3 胶孢炭疽菌侵染策略  14-15
    1.4 炭疽菌致病相关基因的研究  15-17
  2 炭疽菌基因组文库研究  17-22
    2.1 基因组文库研究进展及应用  17-19
    2.2 Cosmid载体  19-20
    2.3 炭疽菌基因组文库  20-22
  3 农杆菌介导的T-DNA转化及插入突变  22-28
    3.1 丝状真菌遗传转化的研究进展  22-23
    3.2 农杆菌介导的T-DNA转化  23-27
    3.3 T-DNA插入突变的可行性分析  27-28
  4 侧翼序列克隆技术研究  28-33
    4.1 反向PCR(Inverse PCR,IPCR)  29-30
    4.2 热不对称交错PCR(Thermal Asmmetric Interlaced PCR)  30-31
    4.3 外源接头PCR  31-33
  5 研究背景及研究内容  33-34
第二章 柿树炭疽菌粘粒基因组文库的构建及鉴定  34-60
  引言  34-35
  1 材料与方法  35-45
    1.1 试验材料  35-37
    1.2 试验方法  37-45
  2 结果与分析  45-56
    2.1 高分子量基因组DNA的制备  45-48
    2.2 插入片断的制备  48-49
    2.3 SuperCos1粘粒载体的制备  49-51
    2.4 连接、包装及转染  51
    2.5 包装反应物的滴度测定  51-52
    2.6 文库的扩增与保存  52-53
    2.7 扩增后粘粒基因组文库滴度测定  53-54
    2.8 文库质量鉴定  54-56
  3 小结与讨论  56-60
    3.1 SuperCos1粘粒载体的优点  56-57
    3.2 提取柿树炭疽菌基因组DNA的方法优化  57
    3.3 柿树炭疽菌基因组DNA的部分消化  57-58
    3.4 库质量鉴定  58
    3.5 文库的保存  58-60
第三章 柿树炭疽菌的农杆菌介导转化、鉴定及突变体初步筛选  60-74
  引言  60-61
  1 材料与方法  61-67
    1.1 试验材料  61-63
    1.2 试验方法  63-67
  2 结果与分析  67-72
    2.1 农杆菌AGL-1电转化产物的PCR鉴定  67
    2.2 柿树炭疽菌的T-DNA转化  67-68
    2.3 柿树炭疽菌转化子检测  68-70
    2.4 转化子生物学特性变异分析  70-71
    2.5 转化子致病性测定及致病性相关突变体筛选  71-72
  3 小结与讨论  72-74
    3.1 柿树炭疽菌共培养时间的比较  72-73
    3.2 双元载体的分析  73
    3.3 乙酰丁香酮(AS)对转化的影响  73
    3.4 转化条件的优化及结果  73-74
第四章 柿树炭疽菌无致病性突变体生物学特性及SOUTHERN杂交分析  74-90
  引言  74-75
  1 材料与方法  75-80
    1.1 试验材料  75-77
    1.2 试验方法  77-80
  2 结果与分析  80-88
    2.1 柿树炭疽菌无致病性突变体生物学特性分析  80-85
    2.2 致病性测定  85
    2.3 无致病性突变体Southern杂交分析  85-88
  3 小结与讨论  88-90
    3.1 柿树炭疽菌无致病性突变体生物学特性及致病性分析  88
    3.2 柿树炭疽菌无致病性突变体Southern杂交分析  88
    3.3 转化子拷贝数影响因素分析  88-90
第五章 柿树炭疽菌无致病性突变体侧翼序列扩增及分析  90-126
  引言  90-91
  1 材料与方法  91-100
    1.1 试验材料  91-93
    1.2 试验方法  93-100
  2 结果与分析  100-123
    2.1 柿树炭疽菌无致病性突变体Cg-10的侧翼序列扩增及序列分析  100-108
    2.2 柿树炭疽菌无致病性突变体Cg-32的侧翼序列扩增及序列分析  108-117
    2.3 柿树炭疽菌无致病性突变体Cg-613的侧翼序列扩增及序列分析  117-123
  3 小结与讨论  123-126
    3.1 侧翼序列扩增方法比较  123-124
    3.2 T-DNA插入特点分析  124-125
    3.3 突变体功能预测分析  125-126
全文小结  126-127
参考文献  127-141
附录  141

相似论文

  1. 稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建,R96
  2. 小学美术教学中联想思维的转化训练,G623.75
  3. 粤东农村地区初中数学学业不良生的现状与转化策略研究,G633.6
  4. 高中数学学困生的有效转化策略探究,G633.6
  5. 利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建,S435.72
  6. 虾池一株微藻对尿素和甲硫氨酸利用效率的研究,S968.22
  7. rd29A驱动RdreBlBI基因转化‘红颊’草莓的研究,S668.4
  8. 恩替卡韦联合TACE治疗伴乙肝病毒复制的原发性肝癌效果分析,R735.7
  9. 甜菊苷的定向转化及产物甜茶苷的分离纯化,S566.9
  10. 弯孢属种分子鉴定体系的建立及其在疑难种上的应用,Q949.32
  11. 功能化纳米二氧化钛多孔材料的制备、表征及性能研究,TB383.1
  12. 一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析,S435.654
  13. 丁香假单胞菌番茄致病变种和烟草致病变种egfp标记突变体的构建,S436.412
  14. 转基因稻米及其米制品外源重组DNA的检测,S511
  15. 新疆紫草细胞的稀土生物学效应及遗传转化,S567.239
  16. 海藻糖改善枯草芽孢杆菌电转化方法的研究,Q78
  17. 基于遗传算法优化的BP网络对生物柴油制备工艺的优化,TE667
  18. 水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建,S435.111.42
  19. 寄主型和迁飞型棉蚜在交配行为、mtDNA与共生菌相关基因上的分化,S433
  20. 江苏省小麦孢囊线虫的发生调查及其核糖体DNA-ITS序列分析,S435.121
  21. 瓜类细菌性果斑病菌致病相关基因筛选及luxR基因功能分析,S436.5

中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 杂果类病虫害
© 2012 www.xueweilunwen.com