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除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）的基因工程改造

作　者: 张亮
导　师: 覃重军
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 除虫链霉菌调节基因接合转移基因组文库
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 172次
引　用: 3次
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内容摘要

阿维菌素（avermectins,AVM）是由除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的十六元环内酯类多组份抗生素,按其分子中C-5、C22-23、C26三个位置上的结构差异性可区分为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b 8种组份。其中以B1组份,特别是B1a的抗线虫、节肢动物活性最高,而被广泛用于家畜寄生虫感染的治疗和农业虫害防治,成为农牧业的重要抗生素。本项研究工作以阿维菌素工业生产菌株MMR630和实验室菌株NRRL8165为研究对象,通过实验,我们最终确定了选用整合型载体pSET152,通过大肠杆菌-链霉菌接合转移的方法,将外源DNA导入除虫链霉菌中。实验中通过PCR方法,分别扩增得到两个除虫链霉菌自身的参与调节抗生素生物合成的基因aveR和orfX,同时,由于除虫链霉菌的基因组同天蓝色链霉菌A3（2）有着极高的同源性,我们也扩增出已经报导的对A3（2）抗生素产量有作用的基因afsR,通过大肠杆菌到链霉菌之间能够进行高效接合转移的载体pSET152,分别将这些基因导入除虫链霉菌MMR630中,接合转移频率可以达到10^-6。在验证了这些基因已经稳定地整合到染色体上后,我们将含有调控基因aveR、orfX和afsR的菌株进行了发酵试验,发酵结果显示,这些菌株所产生的阿维菌素B1a组分分别是出发菌株MMR630的2.5倍、2倍和2.9倍。通过同源重组在染色体上对阿维菌素生物合成基因簇进行改造比较费时和麻烦。本研究正进行对除虫链霉菌NRRL8165全基因组文库的构建。已经完成了NRRL8165总DNA的部分酶切和蔗糖梯度离心工作,目前正在完成构建文库的载体的工作,随着全基因组文库的构建完成,将为阿维菌素生物合成基因的克隆,开展对除虫链霉菌次生代谢的进一步研究奠定坚实的基础。

全文目录

全文摘要  4-5
英文摘要  5-6
综述部分  6-24
  阿维菌素研究进展及其在抗生素生产中的应用  6-24
论文部分  24-60
  第一章在除虫链霉菌MMR630 中导入调控基因aveR、orfX 和afsR 后对阿菌素产量的影响  24-51
    第一节除虫链霉菌遗传转化方法的建立  24-36
      前言  24
      材料与方法  24-27
      实验结果  27-33
      讨论  33-35
      参考文献  35-36
    第二节向除虫链霉菌MMR630 中导入调控基因aveR、orfX 和afsR 后引起阿维菌素产量的提高  36-51
      前言  36-37
      材料与方法  37-39
      实验结果  39-47
      讨论  47-50
      参考文献  50-51
  第二章除虫链霉菌NRRL8165 全基因组文库的构建  51-60
    前言  51
    材料与方法  51-58
    结果与讨论  58-59
    参考文献  59-60
致谢  60

除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）的基因工程改造

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