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稻瘟病菌Magnaporthe oryzae高效转化文库的构建

作　者: 张福生
导　师: 王洪凯
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 基因组文库 cosmid ATMT 电击转化
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)能引起水稻上的一种重要病害-稻瘟病,了解其致病过程和机理对于防治稻瘟病有重要作用。同时,作为丝状真菌致病机理与分子生物学研究的重要模式菌,M.oryzae功能基因的克隆对于了解其他病原真菌与寄主的互作也具有重要意义。基因文库是克隆基因并研究其功能的重要手段,大容量的基因文库结合有效的转化方法,是通过表型互补进行基因克隆的基础。特别是条件突变体(如温度敏感型突变体等),通过表型互补克隆相关基因是一种基本的方法。本研究构建了稻瘟菌Cosmid基因组文库,为ATMT基因组文库的构建制备了所需的基因组DNA和处理了载体pBHT2,同时对稻瘟病菌电击转化进行了初步探索,为进一步通过表型互补克隆相关基因打下了基础。现总结如下:1)稻瘟病菌cosmid基因组文库构建采用SuperCos1载体构建了稻瘟病菌菌株Guy-11基因组文库。利用SDS及蛋白酶K法提取高质量基因组DNA,并用4个碱基识别位点的限制性内切酶Sau3AI对基因组进行不完全酶切,获得大小约40kb的基因组片段,连接包装后,转染XL1-Blue MR细菌,最终获得4.0×10~4个粘粒克隆,相当于每微克基因组DNA约产生10~5个粘粒克隆,粘粒克隆混合于15%甘油中并于-70℃下保存。对50个随机重组子分析表明,98%的重组子含有外源DNA片段,片段平均大小为40.5kb。按照稻瘟病菌基因组DNA大小为40Mb计算,库容量已高达31.75。同时,根据Clarke和Carbon公式N=1n(1-p)/1n(1-f)计算分析表明,理论上从该文库中筛选到任一DNA序列的概率在99.99%以上。对扩增保存后文库菌液滴度测定显示该文库滴度约为4.6×10~8cfu/ml,而进行3次反复冻融后,其滴度仍可达4.0×10~8cfu/ml。各项实验结果均表明本实验构建的粘粒基因组文库质量比较高,为进一步功能基因的筛选分离提供了保障。2)构建稻瘟病菌ATMT库所需基因片段的制备及载体的处理要采用pBHT2质粒Sau3A1酶切载体构建稻瘟病菌基因组文库,利用SDS及蛋白酶K方法提取了高质量的基因组DNA,并用4个碱基识别位点的限制性内切酶Sau3AI对基因组DNA进行不完全酶切,获得大小8-15kb片段。并对载体pBHT2进行酶切处理,进行去磷酸化,使其达到了建库的标准。3)稻瘟病菌高效转化方法的探索本实验主要对电击转化的各种条件进行探索,主要包括电击缓冲液,电击电压,电击条件下原生质体的制备。以期能够获得高效转化最佳条件,结果发现电击转化并不能成倍提高转化效率。

全文目录


致谢  5-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第一章 文献综述  12-25
  1 稻瘟病菌研究进展  12-17
    1.1 稻瘟病菌在侵染循环中的发展  12-14
    1.2 稻瘟病菌在分子水平的主要进展  14-17
  2 稻瘟病菌研究常用的转化方法  17-19
    2.1 根癌农杆菌介导整合转化方法  18
    2.2 电击转化法  18-19
    2.3 聚乙二醇介导的转化方法  19
  3 基因文库研究进展及应用  19-23
    3.1 载体的选择  21
    3.2 Cosmid载体的优点  21-22
    3.3 稻瘟病菌基因组文库研究  22-23
  4 本研究的目的意义  23-25
第二章 实验材料方法  25-43
  1 实验材料  25-29
  2 试验方法  29-43
第三章 结果与分析  43-60
  1 稻瘟病菌cosmid基因组文库的构建  43-54
    1.1 高分子量基因组DNA的制备  43-45
    1.2 插入片断的制备  45-47
    1.3 SuperCos1粘粒载体的制备  47-48
    1.4 连接、包装及转染  48-49
    1.5 包装反应物的滴度测定  49-50
    1.6 文库的扩增与保存  50-51
    1.7 扩增后粘粒基因组文库滴度测定  51-52
    1.8 文库质量鉴定  52-54
  2 构建稻瘟病菌ATMT文库所需基因片段的制备及载体的处理  54-57
    2.1 基因组DNA的制备  54-55
    2.2 插入片断的制备  55-56
    2.3 质粒载体的处理  56-57
  3 原生质体电击转化方法的探索  57-60
    3.1 电击缓冲液  57
    3.2 电击电压  57-58
    3.3 电击时间  58
    3.4 转化子的验证  58-60
第四章 总结与讨论  60-65
  1 总结  60-61
    1.1 稻瘟病菌cosmid基因组文库构建  60
    1.2 构建稻瘟病菌ATMT库所需基因片段的制备及载体的处理  60
    1.3 稻瘟病菌高效转化方法的探索  60-61
  2 讨论  61-65
    2.1 稻瘟病菌cosmid文库的构建  61-63
    2.2 构建稻瘟病菌ATMT文库所需基因片段的制备及载体的处理  63-64
    2.3 稻瘟病菌转化方法的探索  64-65
参考文献  65-71
附录:  71-72
作者简历:  72

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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