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鼠疫耶尔森氏菌与小鼠巨噬细胞蛋白相互作用的研究

作　者: 杜宗敏
导　师: 杨瑞馥
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 鼠疫耶尔森氏菌 致病机制 病原与宿主相互作用 蛋白芯片 细菌双杂交
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


鼠疫耶尔森氏菌是鼠疫的病原体,曾引发三次鼠疫世界大流行。鼠疫菌与宿主巨噬细胞的相互作用是其致病机制的重要环节。本研究试图通过研究鼠疫耶尔森氏菌与巨噬细胞之间的蛋白相互作用进一步深入了解鼠疫菌的致病机制。我们首先建立和优化了蛋白芯片筛选鼠疫菌与巨噬细胞相互作用的方法,用包含149个鼠疫菌毒力相关蛋白的蛋白芯片筛选出17个能与巨噬细胞蛋白相互作用的鼠疫菌蛋白。其中除LcrG、YscW和YscB为鼠疫菌重要毒力因子低钙响应元件的成员、katY为过氧化物歧化酶外,其余蛋白为推测的原噬菌体基因编码蛋白或推测的未知功能蛋白。间接免疫荧光结果显示8个芯片反应中信号最强的蛋白LcrG,YscB,Yscw,YpPCP1.06,YpMT1.25ac,YpMT1.24c,YP02090,YP02108均能与巨噬细胞相互作用,初步证实筛选结果比较可靠性。利用噬菌体重组技术构建相应蛋白表达缺陷的鼠疫菌突变株,分析突变株对巨噬细胞的细胞毒性和在BALB/c小鼠中的LD50,发现两者的突变株在小鼠模型中的毒力显著下降,表明鼠疫菌LcrG和YscB蛋白在其致病机制中有非常重要的作用。利用细菌双杂交技术以鼠疫菌LcrG和Yscw蛋白为诱饵蛋白筛选巨噬细胞J774A.1的cDNA文库,发现LcrG在巨噬细胞内作用的靶蛋白为Rp139和Txn2,YscW作用的靶蛋白为Rnf149。Trx-2和Rnf149分别为硫氧还原蛋白和RING结构泛素连接酶相关的蛋白,它们在细胞的正常生理活动中发挥重要的作用,与细胞的免疫响应、信号转导等紧密相关。我们将继续深入研究这些蛋白相互作用,揭示它们在鼠疫菌致病机制中发挥的作用。本研究首次将蛋白芯片用于筛选细菌与宿主之间的蛋白相互作用的研究,并筛选出一些与鼠疫菌毒力相关的靶标蛋白,发现LcrG和YscW在巨噬细胞内作用的靶蛋白,为揭示鼠疫菌与宿主间相互作用的机制奠定基础。

全文目录


中文摘要  5-6
Abstract  6-8
第一部分 绪论  8-32
  1.病原微生物与宿主的相互作用  8-13
  2.鼠疫耶尔森氏菌的毒力因子以及与宿主细胞的相互作用  13-21
  3.高通量的蛋白质相互作用的研究方法  21-23
  4.本研究的目的和意义  23-32
第二部分 蛋白芯片筛选鼠疫耶尔森氏菌与巨噬细胞蛋白的相互作用  32-45
  1.引言  32-34
  2.材料与方法  34-37
  3.结果  37-41
    3.1 蛋白芯片技术的条件优化  37-39
    3.2 蛋白芯片筛选结果  39-41
  4.讨论  41-43
  5.结论  43-45
第三部分 免疫荧光实验验证鼠疫菌蛋白与巨噬细胞蛋白的相互作用  45-58
  1.引言  45
  2.材料与方法  45-50
  3.结果  50-54
    3.1 重组蛋白的制备和抗体的标记  50-51
    3.2 免疫荧光实验和激光共聚焦显微镜观察结果  51-54
  4.讨论  54-55
    4.1 基因组编码蛋白与鼠疫菌致病性之间的关系  54
    4.2 质粒编码蛋白与鼠疫菌致病性之间的关系  54-55
  5.结论  55-58
第四部分 鼠疫菌候选毒力因子突变株的毒力分析  58-71
  1.引言  58
  2.材料与方法  58-62
  3.结果  62-67
    3.1 突变株构建  62
    3.2 鼠疫菌突变株感染J774A.1后的形态学改变  62-64
    3.3 鼠疫菌LcrG和YscB突变株抑制J774A.1分泌TNF-α的能力下降  64
    3.4 LcrG和YscB突变株对小鼠的LD_(50)下降  64-67
  4.讨论  67-69
    4.1 鼠疫菌毒力因子突变株对巨噬细胞毒性的变化  67-69
    4.2 鼠疫菌毒力因子突变株对BALB／c小鼠的毒力改变  69
  5.结论  69-71
第五部分 细菌双杂交技术筛选鼠疫菌毒力因子在巨噬细胞中作用的靶蛋白  71-91
  1.引言  71-72
  2.材料与方法  72-81
  3.结果  81-86
    3.1 cDNA文库的构建  81-84
    3.2 诱饵蛋白表达载体的构建和自激活检测  84-85
    3.3 cDNA文库筛选  85-86
  4.讨论  86-88
    4.1 YscW与Rnf149的相互作用可能有利于鼠疫菌在巨噬细胞内的生存  86-87
    4.2 LcrG与Trx-2的相互作用可能影响宿主细胞内的氧化还原调节通路  87-88
  5.结论  88-91
第六部分 小结  91-94
综述  94-108
博士生在读期间发表的论文  108-109
致谢  109

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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