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AIV、AILT、IBD病毒抗体可视化诊断蛋白芯片的研制与应用

作　者: 刘子一
导　师: 李刚；何建斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: 禽流感传染性喉气管炎传染性法氏囊蛋白芯片
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了三种禽病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于(?)基修饰的片基上,制备蛋白芯片；分别与三种禽病阳性血清杂交,再与金标二抗杂交,银染显色后读取结果,建立三种禽病的可视化蛋白芯片工作平台；进一步对此芯片的特异性以及灰度值与抗体浓度的相关性进行了研究；最后对18个临床血清样品进行了初步应用检测。结果显示经过条件优化后,芯片检测探针可特异性的相应的抗体进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。信号灰度值在抗体浓度为50μg/mL～300μg/mL范围内成线性关系。用芯片和其它传统抗体检测方法同时检测18份临床样品,结果发现可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且灵敏性明显高于传统检测手段。经过一系列条件的优化,构建了可同时鉴别检测三种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片；该芯片具有快速、简便、灵敏、特异性的特点,无需特殊仪器,成本低。血清样品检测可信度高,且灵敏度高于琼脂扩散试验,可推广到基层使用。该方法同时结合免疫胶体金技术,银显影技术以及蛋白芯片技术,并且首次以纯化的全病毒蛋白作为捕获抗原,是血清学检测技术的创新和突破。可视化蛋白芯片为芯片技术的推广起到重要的推动作用,该技术为未来开发可检测多种抗体的高密度、集成化芯片的问世与推广打下良好的基础。利用重组NS1蛋白为抗原,建立目视化蛋白芯片。实验中把表达的NS1蛋白稀释为3000μg/ml。用蛋白芯片分别检测已知的AI感染血清和免疫血清各25份,SPF鸡血清、ND阳性血清、IBD阳性血清各10份。感染血清和免疫血清检测结果符合率100%,显示该方法具有良好的准确性。SPF鸡血清、ND阳性血清、IBD阳性血清检测无非特异性反应,说明蛋白芯片具有良好的特异性。用蛋白芯片对采集的不同时间点的实验感染血清进行检测,在感染第8天检出,而用琼脂扩散试验在感染第14天检出,蛋白芯片灵敏度明显高于琼扩检测方法。实验建立的蛋白芯片诊断平台,可以快速、准确的区分禽流感野毒感染和疫苗免疫家禽,检测结果仅凭肉眼即可判断,利于临床使用,是禽流感的监控和净化技术的新突破。

全文目录

摘要  5-6
英文摘要  6-11
第一章绪论  11-15
  1.1 三种禽病的概述  11-12
    1.1.1 禽流感  11
    1.1.2 鸡传染性喉气管炎  11-12
    1.1.3 传染性法氏囊病  12
  1.2 蛋白芯片概述  12-13
    1.2.1 蛋白分子的获得  12
    1.2.2 芯片载体(基片)的选择  12-13
    1.2.3 点样方式的选择  13
    1.2.4 反应条件的优化  13
  1.3 蛋白芯片的主要用途  13-14
    1.3.1. 蛋白芯片在生物医学上的研究与临床诊断中的应用  13
    1.3.2 蛋白质芯片在药物筛选、药理毒理方面的应用  13
    1.3.3 蛋白质芯片在食品卫生监督及分析中的应用  13-14
    1.3.4 蛋白质芯片技术在兽医诊断学上的应用  14
  1.4 国内外研究现状  14
  1.5 研究意义  14-15
第二章可视化蛋白质芯片平台的建立  15-22
  2.1 引言  15
  2.2 实验材料  15
    2.2.1 主要材料和仪器  15
    2.2.2 主要试剂及溶液  15
  2.3. 实验方法  15-17
    2.3.1 病毒蛋白的纯化  16
    2.3.2 通用点样、封闭、杂交及扫描程序  16
    2.3.3 检测蛋白芯片的制备及平台的建立  16-17
    2.3.4 抗体的浓度与灰度值的相关性分析  17
  2.4 实验结果  17-20
    2.4.1 抗原蛋白的浓缩与纯化  17
    2.4.2 固定时间与灰度值的关系  17-18
    2.4.3 不同封闭液的效果比较  18
    2.4.4 点样浓度的选择  18-19
    2.4.5 抗体浓度与灰度值的关系  19
    2.4.6 不同银染时间对灰度值的影响  19-20
    2.4.7 抗体浓度与灰度值的相关性分析  20
  2.5 讨论  20-22
第三章可视化蛋白质芯片在检测三种禽病毒抗体中的应用研究  22-26
  3.1 材料和方法  22-23
    3.1.1 种毒与血清  22
    3.1.2 主要试剂  22
    3.1.3 三种禽病毒抗体检测芯片的制备  22-23
    3.1.4 特异性实验  23
    3.1.5 敏感性实验  23
    3.1.6 临床血清样品检测  23
  3.2 试验结果  23-25
    3.2.1 芯片与已知血清杂交特异性试验  23-24
    3.2.2 Cutoff值的确定  24
    3.2.3 检测限的评估  24
    3.2.4 与琼脂扩散试验的对比实验  24
    3.2.5 临床血清样品检测  24-25
  3.3 讨论  25-26
第四章区分禽流感野毒感染和疫苗免疫抗体的可视化蛋白芯片方法的建立  26-32
  4.1 材料和方法  26-27
    4.1.1 试验材料  26
    4.1.2 主要仪器和材料  26
    4.1.3 蛋白纯化及活性鉴定  26
    4.1.4 蛋白芯片的制备  26-27
    4.1.5 特异性和准确性试验  27
    4.1.6 与琼脂扩散试验做对比试验  27
  4.2 结果  27-31
    4.2.1 蛋白活性分析  27-28
    4.2.2 抗原浓度的选择  28
    4.2.3 蛋白芯片特异性和准确性试验  28-30
    4.2.4 比较芯片和琼扩对实验感染鸡血清的检测结果  30
    4.2.5 蛋白芯片的保存时间  30-31
  4.3 讨论  31-32
第五章全文结论  32-33
参考文献  33-36
致谢  36-37
作者简历  37

AIV、AILT、IBD病毒抗体可视化诊断蛋白芯片的研制与应用

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