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重组HDL-抗乙肝病毒药物复合物的制备及其肝靶向作用的研究

作　者: 蔡钦生
导　师: 周珮
学　校: 复旦大学
专　业: 药物化学
关键词: 载脂蛋白 A-I 基因工程 apoA-I 高密度脂蛋白前体药物肝靶向那西肽阿昔洛韦阿昔洛韦棕榈酸酯抗乙肝病毒药物重组 HDL-那西肽复合物重组 HDL-阿昔洛韦棕榈酸酯复合物
分类号: R943
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

HDL 由载脂蛋白 A-I(Apolipoprotein A-I,apoA-I)、卵磷脂、胆固醇等组成,可接受肝外组织细胞流出的胆固醇将其带回肝脏,并通过其 apoA-I 与肝细胞表面 HDL受体识别途径,将胆固醇酯释放入肝细胞,实现胆固醇从肝外细胞逆转运回肝脏。apoA-I 约占 HDL 总蛋白的 70%,分子量为 28331,由 243 个氨基酸残基组成,其中44~243 氨基酸残基组成了 8 个含 22 残基和 2 个含 11 残基的亲脂性强的 α 螺旋结构。ApoA-I 起稳定 HDL 结构与识别、结合 SR-BI 等 HDL 受体的作用。本研究分别采用了 DS.50-MnCl2法从人血浆提取获得 apoA-I, 冷丙酮-MnCl2法从 FⅣ提取获得 apoA-I, 冷丙酮-等电点法从基因工程毕赤酵母菌表达物提取获得基因工程apoA-I。这些apoA-I经Dot blotting 和 125I放射法测定均具有与SMMC-7721肝细胞、HepG2 2.2.15 肝细胞和大鼠肝脏细胞结合的生物活性。同时对阿昔洛韦进行了前药设计合成,利用阿昔洛韦和棕榈酰氯合成阿昔洛韦的前体药物阿昔洛韦棕榈酸酯,收率达 68.0%。并通过紫外可见扫描光谱、红外吸收光谱、质谱及 H 核磁共振谱、13C 核磁共振谱、重水交换谱、BB-DEPT 谱、1H-1H COSY 1谱、 1H-1H TOCSY 谱、HSQC 谱及 HMBC 谱等确证该化合物为设计前药。应用脱氧胆酸钠法和超声法可制备重组 HDL-那西肽复合物和重组 HDL-阿昔洛韦棕榈酸酯复合物;其中脱氧胆酸钠法可将复合物粒径调控到约 20nm。采用 HepG2 2.2.15 肝细胞模型进行抗乙肝病毒试验。结果显示人源 apoA-I 与基因工程 apoA-I 的重组 HDL-那西肽复合物对 HBsAg 和 HBeAg 抑制率相当。以 HBsAg抑制率 50%为指标,二者的抗病毒能力都是那西肽脂质体的 4 倍,是游离那西肽的20 倍。重组 HDL-阿昔洛韦棕榈酸酯复合物的抗乙肝病毒试验结果显示:人源 apoA-I与基因工程 apoA-I 的重组 HDL-阿昔洛韦棕榈酸酯复合物对 HBsAg 和 HBeAg 抑制率也相当;以 HBsAg 抑制率 20%为指标,二者的抗病毒能力都是阿昔洛韦棕榈酸酯脂 3<WP=6>复旦大学博士学位论文质体的 20 倍,是游离阿昔洛韦棕榈酸酯的 20 倍,是阿昔洛韦脂质体的 40 倍,是游离阿昔洛韦的 200 倍。大鼠体内靶向试验显示,相比游离药物在肝脏的含量17.5%和血浆的含量53.3%, 人源 apoA-I 与基因工程 apoA-I 药物复合物在肝脏的含量分别达到 76.9%和 71.2%,而血浆含量只有 8.5%和 10.2% 。由此可见,人源 apoA-I 和基因工程 apoA-I 的重组 HDL-抗乙肝病毒药物复合物都具有肝靶向作用。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-10
第一部分人 apoA-I 与基因工程 apoA-I 的分离纯化、鉴定及生物活性测定  10-33
  引言  10
  1 材料试剂和仪器  10-13
    1.1 材料及细胞模型及实验动物  10-11
    1.2 试剂  11
    1.3 溶液  11-13
    1.4 主要仪器  13
  2 实验方法  13-19
  3 结果与分析  19-31
    3.1 人血浆 apoA-I 的提取  19-21
    3.2 从血制品废弃组分 FⅣ中提取 apoA-I  21-23
    3.3 从基因工程毕赤酵母菌表达发酵液中获取 apoA-I  23-27
    3.4 apoA-Ⅰ生物活性的检测  27-31
  4 讨论  31-32
  小结  32-33
第二部分阿昔洛韦的前体药物阿昔洛韦棕榈酸酯的合成与分析  33-42
  引言  33
  1 试剂及仪器  33-34
    1.1 试剂  33
    1.2 溶液  33-34
  2 实验方法  34-35
  3 结果与分析  35-41
    3.1 阿昔洛韦棕榈酸酯合成与纯化  35-36
    3.2 化合物理化性质  36
    3.3 化合物的结构表征  36-39
    3.4 ＨＰＬＣ流动相的组成与流速的确定  39
    3.5 外标工作曲线的建立  39
    3.6 回收率的精密度  39
    3.7 不同反应时间反应液中阿昔洛韦棕榈酸酯的含量检测  39-41
  4 讨论  41
  小结  41-42
第三部分重组 HDL-药物复合物的制备及其体外抗乙肝病毒和体内肝靶向作用的研究  42-72
  引言  42-43
  1 材料试剂和仪器  43-44
    1.1 细胞模型与实验动物  43
    1.2 试剂  43
    1.3 溶液  43-44
  2 实验方法  44-49
  3 结果与分析  49-70
    3.1 蛋卵磷脂的提取  49
    3.2 重组ＨＤＬ－那西肽复合物的制备  49-58
    3.3 重组ＨＤＬ阿昔洛韦棕榈酸酯复合物的制备  58-61
    3.4 那西肽、阿昔洛韦棕榈酸酯及阿昔洛韦脂质体的制备  61-63
    3.5 药物的体外抗乙肝病毒作用试验  63-68
    3.6 体内靶向肝细胞的研究  68-70
  4 讨论  70-71
  小结  71-72
参考文献  72-75
结语  75-76
综述肝炎病毒、抗病毒药物及肝靶向载药系统的研究进展  76-110
致谢  110-111
附录  111-112
附图  112-129

重组HDL-抗乙肝病毒药物复合物的制备及其肝靶向作用的研究

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