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戊型肝炎病毒在家禽、家畜中的流行及其ORF3蛋白与人肝细胞蛋白相互作用的研究

作　者: 耿彦生
导　师: 王佑春
学　校: 北京协和医学院
专　业: 病原生物学
关键词: 戊型肝炎病毒 HEV-抗原 HEV-抗体 HEVORF3蛋白 酵母双杂交实验 蛋白质相互作用 免疫共沉淀实验
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)是戊型肝炎的病原体,是一种重要的传染因子。逐渐积累起来的研究结果显示戊型肝炎是一种人兽共患病,自然界存在HEV的动物宿主。我国是戊型肝炎的流行区,既有爆发流行也有散发病例,近年来散发病例报告数持续增加,可能与动物源性HEV的传播有关。了解HEV在我国动物中的流行情况,对于预防和控制戊型肝炎的流行、减少发病具有重要意义。在本研究中,我们从不同省份采集我国主要饲养动物的血清,对HEV在各种动物中的感染率、感染水平进行了调查分析,并对HEV基因型、基因亚型的分布进行了分析研究。为了进一步探索HEV感染、致病以及不同基因型别HEV宿主差异的分子机制,我们应用酵母双杂交系统对人肝cDNA文库进行筛选,筛选了与HEV ORF3蛋白有相互作用的蛋白分子,并对不同基因型HEV ORF3蛋白与肝细胞蛋白的相互作用进行比较；通过对这些蛋白分子的生物学信息分析,对ORF3蛋白的功能及其对宿主细胞生物过程可能产生的影响进行了分析、推测。1.HEV在我国家畜、家禽中流行情况的调查从我国的27个省(市)共采集了猪、牛、羊、家兔、鸡和鸭血清6329份,应用EIA方法测定血清中HEV抗体和抗原。结果显示,猪、牛、羊和家兔的平均HEV抗体阳性率分别为82.2%、28.2%、10.4%和15.4%,猪HEV抗体阳性率明显高于牛、羊和家兔。鸡和鸭的抗体阳性率分别为3.58%和7.1%,二者都明显低于猪、牛羊和家兔。来源于不同省份的动物HEV抗体的阳性率有明显差异,猪、牛、羊和家兔HEV抗体阳性率范围分别为10.9%-100%、0～92.9%、0～48%和0-53.4%。大约1.9%的猪、0.8%的牛、1.6%的羊以及3.8%的兔血清样本为HEV抗原阳性。鸡和鸭的抗原阳性率分别为1.79%和1.43%。应用Nested RT-PCR在15份猪血清和22份不同品种的家兔的血清中检测到了HEV RNA,而牛、羊、鸡和鸭血清中未检测到HEV RNA。通过对ORF2区域304bp长的核苷酸序列进行比对和进化树分析,15株猪HEV均属于基因4型。在进化树上,这15株4型HEV被分在不同的四组,分别为4a、4d及两个新的亚型。综合分析表明,我国猪群中流行的HEV主要为基因4型HEV,包括4a,4b,4d,4f,4g以及本研究新发现的两个亚型。从家兔中分离到的22株HEV均属于兔HEV,在进化树上,兔HEV又进一步分成了3组,很可能代表三个基因亚型。本研究表明HEV在我国家畜、家禽中普遍流行,猪HEV感染率最高,我国流行的猪HEV主要为基因4型,包括4a,4b,4d,4f,4g以及两个新亚型。证实了兔HEV在我国不同地区不同品种的家兔中均有流行,支持兔HEV属于一个新基因型的观点。牛、羊、鸡和鸭血清样本中都检测到了HEV抗原,但未能检测出HEVRNA,仍需进一步研究。2. HEV ORF3蛋白与肝细胞蛋白相互作用的研究本研究以基因1型和4型HEV ORF3蛋白为诱饵,通过酵母配对杂交实验对人肝cDNA文库进行筛选,筛选结果应用酵母杂交共转化实验进行验证。经过三次实验,筛选出了32种与ORF3蛋白有相互作用的肝细胞蛋白。其中4种蛋白(4/32,12.5%)已经有报告能够与ORF3蛋白结合。进一步应用哺乳动物细胞内化学发光免疫共沉淀实验对酵母杂交实验的筛选结果的可靠性进行评估,显示筛选结果的可信度比较高。生物信息学分析发现这32种相互作用蛋白在细胞核、细胞质、细胞膜、细胞外基质、以及线粒体、内涵体膜中均有分布,大多数蛋白定位于细胞的多个部位。这些蛋白分别参与细胞代谢、细胞免疫、细胞黏附等多个生物学过程。因此推测ORF3蛋白可能通过与这些蛋白相互作用,发挥多重作用。通过对蛋白功能富集聚类分析,发现分别有显著多数量的相互作用蛋白参与血液凝固、氧化应激和铁代谢过程。结合戊型肝炎临床表现和肝组织的病理特征进行分析,推测ORF3可能通过与宿主细胞蛋白的相互作用,影响凝血、脂质代谢以及铁代谢,而引发相应的病理过程。通过酵母杂交共转化实验分别检测基因1型HEV、4型HEV、兔HEV以及禽HEV ORF3蛋白与以基因4型和1型HEV ORF3为诱饵筛选到的这32种人肝细胞蛋白是否有相互作用。结果显示,基因1型、4型和兔HEV的ORF3蛋白都能够与这些蛋白结合,然而禽HEV的ORF3蛋白只与其中的13种蛋白有相互作用。因此,禽HEV对人肝细胞的影响作用可能不同于哺乳动物HEV,这种蛋白相互作用的差别是否与禽HEV与哺乳动物HEV宿主范围等的差别有关联,还需要进一步研究。这些发现为我们进一步研究ORF3蛋白的致病作用,以及研究HEV感染、复制和宿主限制性的分子机制提供了线索和方向。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-20
  1.1 HEV的基本病毒学特性  11-13
  1.2 HEV的基因型、基因亚型及不同型别的地理分布  13-17
  1.3 HEV在动物中的流行  17-18
  1.4 HEV的跨种属感染及动物HEv感染人的潜在危险性  18-19
  1.5 本研究的目的和内容  19-20
第一部分 我国家畜、家禽中戊型肝炎病毒(HEV)流行情况的研究  20-47
  1 材料和方法  21-29
    1.1 血清样本的采集、运输和保存  21
    1.2 HEV抗原、抗体的检测  21-22
      1.2.1 HEV总抗体的检测  22
      1.2.2 HEV抗原的检测  22
    1.3 HEV RNA的检测  22-26
      1.3.1 核酸的提取  23
      1.3.2 Nested RT-PCR  23-25
      1.3.3 PCR产物的序列测定  25-26
      1.3.4 基因序列的比对与分析  26
    1.4 血清中HEV RNA的定量  26-27
      1.4.1 样本的准备  26
      1.4.2 Real time PCR  26-27
      1.4.3 病毒载量的计算  27
    1.5 统计学分析  27-29
  2 结果  29-41
    2.1 猪、牛、羊中HEV抗体检测结果  29
    2.2 猪、牛、羊中HEV抗原和RNA的检测结果  29-30
    2.3 家兔中HEV抗体的检测结果  30-31
    2.4 家兔中HEV抗原和RNA的检测结果  31-32
    2.5 兔血清中HEV抗体、抗原以及HEV RNA的相互关系  32-33
    2.6 鸡、鸭中HEV抗体检测结果  33-34
    2.7 鸡、鸭中HEV抗原及HEV RNA的检测结果  34-35
    2.8 HEV基因序列分析结果  35-36
      2.8.1 猪HEV序列分析结果  35
      2.8.2 兔HEV序列分析结果  35-36
    2.9 猪和兔血清中HEV的载量  36-41
  3 讨论  41-47
第二部分 HEV ORF3蛋白与人肝细胞蛋白相互作用的研究  47-92
  1 材料和方法  48-70
    1.1 材料标本  48-52
      1.1.1 基因1型、4型、兔HEV及禽HEV的质粒  48
      1.1.2 Mate&Plate人肝细胞文库  48
      1.1.3 Y2HGold酵母双杂交系统  48-51
      1.1.4 免疫共沉淀系统  51-52
      1.1.5 293FT细胞  52
    1.2 酵母双杂交实验  52-64
      1.2.1 诱饵质粒(pGBKT7-ORF3)的构建  53-57
      1.2.2 诱饵质粒和捕获质粒自激活和毒性鉴定  57
      1.2.3 诱饵质粒的大量制备  57-59
      1.2.4 诱饵质粒转化酵母菌Y2HGold  59-60
      1.2.5 酵母双杂交配对筛选实验  60-61
      1.2.6 酵母双杂交阳性克隆的确认及捕获质粒的提取  61-63
      1.2.7 对捕获质粒(pGADT7-bait)中的Bait基因序列测定及分析  63
      1.2.8 酵母双杂交质粒共转染实验  63-64
    1.3 化学发光免疫共沉淀实验  64-69
      1.3.1 AcGFP1-Bait和ProLabel-Prey质粒的构建  64-67
      1.3.2 AcGFP1-Bait和ProLabel-Prey共转染293FT细胞  67-68
      1.3.3 免疫共沉淀实验  68-69
    1.4 ORF3蛋白与相互作用蛋白的生物信息学分析  69-70
  2 结果  70-87
    2.1 酵母双杂交实验筛选结果  70-78
      2.1.1 HEV ORF3诱饵质粒的构建及毒性和自激活作用的验证  70-72
      2.1.2 酵母配对杂交筛选实验结果  72-78
    2.2 免疫共沉淀反应对酵母双杂交筛选结果的评价  78-80
      2.2.1 ORF3与GFP融合蛋白表达质粒pAcGFP1-ORF3的构建  78
      2.2.2 宿主细胞蛋白与Prolab1标签融合蛋白表达质粒pProlable-Bait的构建  78-79
      2.2.3 HEV ORF3蛋白与肝细胞蛋白真核细胞内免疫共沉淀结果  79-80
    2.3 ORF3蛋白与肝细胞蛋白相互作用网络的拓扑分析  80-82
    2.4 HEV ORF3网络蛋白功能富集聚类分析  82-84
      2.4.1 血液凝固  82-83
      2.4.2 氧化应激  83-84
      2.4.3 铁代谢  84
    2.5 基因1、4型及兔HEVORF3蛋白与宿主蛋白相互作用的比较  84-87
  3 讨论  87-92
小结  92-93
参考文献  93-105
附录 1.本课题所使用的主要仪器  105-106
附录 2.缩略词一览表  106-108
博士期间发表的主要论文  108-109
致谢  109-110

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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