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Neurturin和TH双顺反子重组腺病毒的构建及对恒河猴帕金森氏病模型的组合基因治疗评价

作　者: 王文举
导　师: 孙茂盛
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 帕金森氏病 多巴胺能神经元 Neurturin Tyrosine Hydroxylase 恒河猴 组合基因治疗
分类号: R742.5
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


帕金森氏病(Parkinson’s Diseases, PD)是一种以中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死,多巴胺合成减少为特征的神经系统退行性疾病。主要临床表现：静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常,最后患者多死于由肺部感染引起的并发症。帕金森氏病主要由个体神经系统退化或者滥用药物导致,其病理改变主要为黑质纹状体系统多巴胺能神经元的变性坏死导致多巴胺分泌不足,间接引起从丘脑至大脑皮层的兴奋性谷氨酸投射被抑制。全世界已有高达400万的患病人数,而大约一半在我国。我国是帕金森氏病的高发国家之一,随着中国人口结构老龄化趋势加剧,PD的发病数也会随之增加。目前对于帕金森氏病的临床治疗主要采取药物和手术两种,但是这些治疗方法都具有一定的局限性。由于帕金森氏病的病灶部位仅限于黑质和纹状体两个位点,靶点较为明确,非常有利于基因治疗。Neurturin (NTN)是神经营养因子家族成员之一,研究表明Neurturin能够特异的促进多巴胺能神经元存活,对多巴胺能神经元具有保护作用,使其免于死亡。酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase)是多巴胺合成的限速酶,在多巴胺能神经元中L-Tyrosine在酪氨酸羟化酶的催化下生成左旋多巴(L-DOPA),左旋多巴在芳香族脱羧酶的作用下脱羧生成多巴胺(Dopamine)。因此,酪氨酸羟化酶功能的异常,直接影响到多巴胺的分泌。现阶段,国际上对帕金森氏病基因治疗的研究主要使用神经营养因子Neurturin或者GDNF作为治疗基因,研究者们通过不同的病毒载体将神经营养因子递送至目的核团,促进目的核团中的多巴胺能神经元存活,对其起到保护作用。对帕金森氏病的理想治疗方法是既能阻止病情的恶化,又能缓解病人由于部分多巴胺能神经元损失所导致的帕金森症状。基于这一思路我们设计了用NTN和TH联合治疗的方案在本研究中,我们首先利用搭桥PCR技术将NGF的信号肽和Pro肽与NTN的成熟肽连接,形成一个嵌合的神经营养因子Neurturin (NGFpreproNTN)。我们首先将合成的NTN和TH分别整合到腺病毒的基因组中,在Ad-293细胞中包装出重组病毒,在确认这两种重组病毒在Vero细胞中能够很好的表达后。我们将嵌合Neurturin和酪氨酸羟化酶(TH)构建成一个双顺反子表达盒,把双顺反子表达盒重组到腺病毒基因组中,包装所得到的双顺反子重组腺病毒(HJ326)能在被感染的宿主细胞中能够同时表达。体外活性测定实验证实,该病毒所表达的NTN能够促进鸡胚背根神经节生长,还能促进胎鼠多巴胺能神经元存活。在宿主细胞中表达的TH蛋白能够在体外反应中催化L-Tyrosine转化为L-DOPA。以体外活性实验的结果为基础,我们大量制备了双顺反子重组腺病毒(HJ326)和单独只携带NGFpreproNTN的重组腺病毒(Ad-NTN)。利用这两种病毒我们对恒河猴帕金森氏病模型进行了组合基因治疗。首先,我们对所造的恒河猴帕金森氏病模型进行有效性和时效性验证。在确认模型的有效性和长期验证了模型无自发回复的前提下,在核磁共振的引导下,我们将治疗病毒通过立体定向注射的方法递送到目的核团(黑质、尾核和壳核)。通过对治疗后的模型动物的长期行为恢复评价和生理恢复评价,我们发现双顺反子重组病毒给药组比单独只递送NGFpreproNTN的治疗组具有更快速的行为恢复,而对照组无任何的恢复。Ad-NTN给药组在治疗后的一段时间内还出现了暂时的上下肢运动功能障碍等少量的帕金森症状,而HJ326给药组在治疗后全无任何帕金森症状。在行为评价结束处死动物后,免疫组化显示两种重组病毒都能较好的对多巴胺能神经元进行保护,而对照组动物黑质纹状体系统的多巴胺能神经元被药物形成了较强的损伤。综合上述结果我们不难看出,HJ326治疗组在TH的帮助下形成快速的行为恢复,而Ad-NTN组在给药后,动物在治疗基因NTN的保护作用与药物的损伤效应的一段时间的斗争过程中出现了短暂的帕金森症状。深入对比分析分析两个组的治疗效果,我们推测在HJ326治疗中多导入的TH基因正是缓解了Ad-NTN组中短暂出现的帕金森症状。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
引言  11-20
第一部分 携带嵌合神经营养因子NGFpreproNTN和酪氨酸羟化酶TH重组腺病毒的构建  20-58
  一、实验材料和方法  20-41
    1. 实验材料  20-25
      1.1 基因、重组腺病毒系统和细胞  20-22
      1.2 工具酶及试剂  22
      1.3 引物  22-25
    2. 实验方法  25-41
      2.1 重组穿梭质粒pShuttleCMV-wtNTN的构建  25-26
      2.2 嵌合神经营养因子基因NGFpreproNTN的合成及其重组穿梭质粒的构建  26-27
      2.3 重组穿梭质粒pShuttleCMV-HTH的构建  27-28
      2.4 同源重组将外源基因整合至腺病毒基因组中  28-31
      2.5 携带外源基因的重组腺病毒包装  31-35
      2.6 重组腺病毒的形态学观察  35
      2.7 RT-PCR检测重组病毒在Vero细胞中的转录  35-36
      2.8 免疫荧光检测三个外源基因分别在Vero细胞中的表达  36-37
      2.9 免疫印迹(Western Blot)检测成熟NTN的分泌  37-38
      2.10 鸡胚背根神经节培养实验  38
      2.11 胎鼠中脑多巴胺能神经元存活实验  38-40
      2.12 Ad-HTH的体外活性测定  40-41
  二、实验结果与分析  41-55
    1. wtNTN、NGFpreproNTN和HTH基因的克隆及其重组穿梭质粒的构建  41-43
    2. 重组腺病毒Ad-wtNTN、Ad-NGFpreproNTN、Ad-HTH和Ad-Control的包装  43-46
    3. 重组腺病毒外源插入基因在Vero细胞中的表达  46-51
    4. NTN的体外活性测定  51-53
    5. 毛细管电泳法检测TH酶催化L-tyrosine转化为L-DOPA  53-55
  三、讨论  55-58
第二部分 表达神经营养因子NGFpreproNTN和酪氨酸羟化酶TH双顺反子重组腺病毒的构建  58-89
  一、实验材料和方法  58-74
    1. 实验材料  58-60
      1.1 基因、重组腺病毒系统和细胞  58-59
      1.2 工具酶及试剂  59
      1.3 引物  59-60
    2. 实验方法  60-74
      2.1 双顺反子表达盒及其重组穿梭质粒的构建  60-64
      2.2 双顺反子重组腺病毒的同源重组及鉴定  64-65
      2.3 双顺反子重组腺病毒的包装、扩增和纯化  65-68
      2.4 HJ326在Vero细胞中的表达检测  68-71
      2.5 HJ326表达NGFpreproNTN的体外活性测定  71-73
      2.6 毛细管电泳法对HJ326表达HTH的体外活性的测定  73-74
  二、实验结果及分析  74-87
    1. 双顺反子表达盒的构建及其穿梭质粒的构建  74-75
    2. 双顺反子重组腺病毒(HJ326)的包装  75-76
    3. HJ326氯化铯梯度离心纯化和透射电镜观察  76-77
    4. HJ326在Vero细胞中的表达检测  77-82
    5. HJ326表达NTN和HTH的体外活性测定  82-87
  三、讨论  87-89
第三部分 恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立及组合基因治疗评价  89-109
  一、实验材料及实验动物  89-90
    1. 实验材料  89-90
    2. 实验动物  90
  二、实验方法  90-96
    1. 恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立及有效性和时效性的评价  90-93
      1.1 恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立  90-91
      1.2 对所建动物模型进行评价  91-93
    2. 利用HJ326和Ad-NGFpreproNTN对模型猴进行组合基因  93-95
      2.1 恒河猴单侧帕金森氏病模型的建立  93
      2.2 核磁共振成像(MRI)定位尾状核、壳核和黑质  93-95
      2.3 立体定位注射对模型猴进行基因治疗  95
    3. 基因治疗效果的评价  95-96
      3.1 行为改变和恢复观察  95
      3.2 阿扑吗啡诱导旋转实验  95-96
      3.3 免疫组化评价神经生理恢复  96
  三、动物实验结果  96-107
    1. 恒河猴单侧帕金森氏病模型的行为评价  96-98
    2. 免疫组化和HE染色评价模型猴神经生理改变  98-99
    3. 核磁共振成像定位注射靶点  99-101
    4. 组合基因治疗效果的观察和评价  101-107
  四、讨论  107-109
结论  109-110
展望  110-111
参考文献  111-116
论文综述  116-126
  参考文献  123-126
附录  126-133
致谢  133-134
研究生简历  134-135

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 震颤麻痹综合征
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