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帕金森小鼠慢性模型建立过程中多巴胺能神经元及其轴突变性的初步研究

作　者: 夏毅
导　师: 高国栋；李立宏
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 帕金森病多巴胺能神经元凋亡 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶轴突变性TH Fluoro-Jade C MPTP
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

帕金森病(Parkinson’disease,PD)是一种常见的中枢神经系统进行性、退行性疾病,而PD的主要病理变化目前被认为是中脑黑质的多巴胺能(Dopaminergic,DAG)神经元特异性的凋亡,并且传统的研究重点也主要集中在对DAG神经元凋亡机制的研究和治疗方面,而以往一直认为轴突变性是伴随神经元死亡后的产物,所以关于轴突变性这方面的研究一直很少。不过近些年研究发现,仅仅阻止神经元凋亡对于抑制PD的病情进展效果十分有限,所以PD发病的另一个重要原因和靶点可能就是关于DAG神经元的轴突变性。虽然目前已经有研究表明PD发病中轴突变性的重要作用,不过对其在PD中具体的作用和机制方面的研究还很少,所以研究轴突变性在PD中的机制及其作用,不仅可以为PD发病机制的理解带来理论革新,还可为我们治疗PD提供新的策略和靶点,具有重大的理论和现实意义。第一部分:MPTP诱导帕金森老龄C57BL小鼠慢性模型的建立目的:利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)对老龄(32～36W)C57BL小鼠中脑多巴胺能神经元的毒性作用,建立一个PD小鼠慢性模型。方法:采用简单随机原则随机分为实验组30只和对照组10只。实验组,腹腔注射MPTP30mg/kg,3.5d一次,连续10次。对照组,给予腹腔注射(ip)与实验组等量的生理盐水,给药时间与第一组完全相同。每次腹腔注射给药后12h随机从实验组中抽取3只,对照组中抽取1只,所以根据给药次数又分了10组。结果:第1～3次(第4～10d)给药后,小鼠表现为0.5～1h内出现严重发抖、并且不愿活动、步伐姿势不协调、尾部伸直竖立、毛发展开等应激性表现,个别可出现癫痫样发作特征。但2h后应激性表现缓慢减弱,12h后基本恢复正常。不过随着小鼠MPTP注射次数的增加(第11～21d),虽然其还有给药后的应激性表现但是症状逐渐消失时间变长,还出现渐进性的自发性活动减少、全身颤抖、背部呈角弓状并僵硬、四肢活动缓慢不协调,以及运动爬行缓慢,PD症状特征逐渐明显并且稳定。从第8次(第28.5d)给药12h后,模型组小鼠爬杆实验评分为1分,而悬挂实验则从第9次(第31.5d)给药12h后,评分为1分。至第10次(第35d)给药12h后两组行为学试验均为0分,其PD症状特征典型、稳定,且不恢复。而对照组小鼠表现正常。结论:老龄小鼠与人类中老年发病年龄近似,容易发生稳定性的中脑SNc内神经元和轴突终末的损伤以及DA含量的减少,而不发生显著的自然恢复的趋势,且慢性模型的DAG神经元丢失在形态学上表现为凋亡状态,是一个缓慢的、渐进发展的过程,这和人类PD发病的病理生理生化过程情况类似,症状稳定,自发恢复现象也不显著,更适合作为帕金森DAG神经元变性机制的研究。所以本实验通过行为学检测对照组和不同注射次数(1～10)的PD小鼠模型组,观察慢性PD模型建立过程中的老龄小鼠的行为学变化。对各给药次数后PD小鼠模型的行为学检测是下一步实验得以顺利进行的基础,且可以与下一步实验中各给药次数后的组织切片染色以及蛋白定量进行对照分析。第二部分:帕金森病多巴胺能神经元轴突变性指标的检测目的:通过观察慢性PD老龄小鼠模型的多巴胺能神经元及其轴突纤维等的数目、损伤情况,从形态学上说明多巴胺能神经元轴突发生了变性;通过利用检测细胞骨架带白β-TubulinⅢ以及与微管稳定性相关的蛋白CRMP2的变化情况,从蛋白定量上以此来验证多巴胺能神经元轴突发生了变性。方法:按照第一部分实验的分组方法,然后对各组动物进行灌注固定并取脑行冰冻切片,利用TH免疫组织化学染色法、FJC组织化学染色法、western blot法说明PD模型DAG神经元胞体变性凋亡与其轴突变性之间的时效关系。结果:TH染色显示模型组在第2次给药后TH阳性细胞数目减少不明显,细胞结构清晰排列整齐。但轴突及树突变细,长度明显缩短,网状交织的轴突变得稀疏,表面不光滑,有的呈串珠样肿胀或轴突中断、丢失。TH阳性纤维OD值显示:第1次给药后小鼠PD模型的双侧纹状体区TH阳性神经纤维OD值与对照组比较P> 0.05,没有统计学差异,提示DAG神经元的轴突以及树突纤维虽有减少,但不明显,所以其密度变化没有统计学差异。而第2次给药后纹状体区的TH阳性神经纤维OD值与对照组比较P<0.05,具有统计学差异。提示了黑质致密部内多巴胺能神经元投射到纹状体的纤维及轴突终末减少,或者运输及再摄取多巴胺的功能下降,甚至消失,通过轴突顺性行输送到纹状体内的DA水平减少,这也是轴突及轴突终末变性的一个标志。FJC组织化学染色法:第1、2次给药后,并未检测到FJC染色阳性神经元。但从第3次给药后开始能够检测到FJC染色阳性细胞,且之后每次给药后都可清楚地观察到FJC染色阳性细胞,但还有部分阳性细胞只剩下胞体,而突起完全消失。β-TubulinⅢ蛋白相对含量:从第二次给药开始与对照组相比有显著性差异(P<0.05),第一次和给药后与对照组无显著性差异(P>0.05)。CRMP2蛋白相对含量:从第二次给药开始与对照组相比有显著性差异(P<0.05),第一次和给药后与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论:MPTP诱导的老龄小鼠PD模型中,轴突变性在发生时间上早于细胞凋亡,推测轴突变性可能作为一种单独的机制或独立于神经元胞体的凋亡或早于凋亡,并在帕金森病发病机制中发挥着重要作用。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-11
ABSTRACT  11-16
前言  16-20
文献回顾  20-44
  一、帕金森病动物模型的研究进展  20-36
  二、PD中的轴突变性  36-40
  三、DAG神经元及其轴突变性的的染色和相关蛋白检测方法  40-44
第一部分： MPTP 诱导帕金森大龄C578L 小鼠慢性的模型建立  44-50
  1 材料  44
  2 方法  44-47
  3 结果  47-48
  4 讨论  48-50
第二部分帕金森病多巴胺能神经元轴突变性指标的检测  50-68
  1 材料  50-53
  2 方法  53-57
  3 结果  57-65
  4 讨论  65-68
小结  68-71
参考文献  71-86
个人简历和研究成果  86-87
致谢  87

帕金森小鼠慢性模型建立过程中多巴胺能神经元及其轴突变性的初步研究

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