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两种血蜱卵源基因的鉴定及抗蜱免疫保护效应的研究

作　者: 田占成
导　师: 殷宏；刘光远；罗建勋
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 长角血蜱 青海血蜱 cDNA表达文库 免疫筛选 功能定性 免疫保护
分类号: S855.9
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


蜱可传播人和动物的多种疾病病原,特别是森林脑炎、新疆出血热、莱姆病等人畜共患病,是最重要的人畜共患病传播媒介之一,严重威胁着人类健康和畜牧业生产。蜱的防治成为畜牧业生产中迫切需要解决的问题。目前采用的化药杀虫剂防治蜱的传统方法存在蜱耐药性和环境污染的缺陷,因此研发新的防控制剂成为必然趋势。本研究拟采用免疫学方法和cDNA末端快速扩增技术,克隆、表达长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和青海血蜱(H. qinghaiensis)的与繁殖发育相关的功能基因,为探索蜱生理行为分子调控机制、评价新型环境友好害虫控制制剂和抗蜱疫苗候选抗原提供平台,填补我国在蜱生理行为干预及防控新制剂研究方面的空白,为我国蜱的防控另辟一条新途径。主要研究结果如下：1)通过免疫学筛选的方法和RACE技术,在已构建的长角血蜱卵cDNA表达文库和青海血蜱中克隆获得了20个有效表达序列标签(EST),目前获得了其中12个基因的全长序列。为进一步解析硬蜱基因编码蛋白具体的生理作用机制奠定了物质基础,为研制抗蜱疫苗建立了候选抗原的平台。2)从长角血蜱卵cDNA文库获得了核糖体蛋白L24的部分序列,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了该基因的全长序列。实时定量RT-PCR分析表明,该基因在长角血蜱的各个组织和发育阶段均表达；在部分饱血雌蜱中,与其他组织相比,L24主要在卵巢和唾液腺中表达,卵和幼蜱发育阶段的核糖体蛋白L24表达水平明显低于其他发育阶段。从青海血蜱和小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)中也分别克隆到了核糖体蛋白L24基因,氨基酸序列比较表明,其同源性较高,只有几个氨基酸发生了变异。HLL24重组蛋白免疫兔体保护性试验结果表明,免疫组与对照组相比,长角血蜱雌蜱各项生理指标下降不显著。3)从长角血蜱卵cDNA表达文库中筛选到了一个长角血蜱热休克蛋白类似物—Hsp70基因。Hsp70基因全长为2311bp,完整阅读框长度为1983bp,编码661个氨基酸,预测分子量为72.5 kDa,等电点为5.2。具有Hsp70家族中高保守功能修饰域和内质网定位蛋白中普遍存在的内质网延伸信号"KDEL"。Hsp70与肩突硬蜱(Ixodes scapularis)Hsp70的氨基酸序列相似性达90%,与原鸡(Gallus gallus)的78kDa葡萄糖调控蛋白前体(78 kDa glucose-regulated protein precursor)相似性为85%。实时定量RT-PCR分析表明：部分饱血的长角血蜱雌蜱的卵巢和唾液腺中的Hsp70表达水平明显高于其他组织。尽管Hsp70的表达水平在饥饿长角血.蜱不同发育阶段表达水平很低,但通过吸血可明显诱导其表达水平的增加。Hsp70的表达水平与温度的变化相一致,表现出了明显的冷热应激典型特征(4℃-37℃)。免疫印迹分析表明：重组长角血蜱Hsp70蛋白免疫兔体制备的抗体与卵粗抗原的100 kDa、72.5 kDa和28.4 kDa的3条天然蛋白条带产生明显反应,但在部分饱血蜱的蛋白抽提物中只检测到一条72.5 kDa的天然蛋白带与之反应。Hsp70重组蛋白的免疫保护性实验表明,该蛋白对长角血蜱雌蜱的饱血程度和产卵率的下降作用影响不明显。综上所述,尽管Hsp70的表达水平可明显通过吸血的生理行为来诱导上调,但定位于内质网的长角血蜱Hsp70作为组成型表达基因可能不适合于用作抗蜱疫苗候选抗原。4)采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了青海血蜱含rabGAP域蛋白(TBC1D13)的全长序列。TBC1D13基因全长为1702bp,编码396个氨基酸,预测分子量为46.09 kDa,等电点为6.0。通过建立的各物种TBC1D13发育遗传树和氨基酸序列比对结果表明：TBC1D13基因的发育遗传进化保守,蜱源TBC1D13与脊椎动物来源TBC1D13形成一个发育分支,远离于昆虫TBC1D13的发育遗传分支。实时定量RT-PCR分析表明：TBC1D13在青海血蜱雌蜱吸血期间,其于唾液腺中的表达水平明显高于其他组织。免疫印迹分析表明,在青海血蜱唾液腺中,天然TBC1D13蛋白的分子量约为49 kDa。重组TBC1D13蛋白免疫兔体诱导了强的免疫反应,产生了较高的抗体滴度。TBC1D13重组蛋白免疫兔体保护性试验结果表明：在统计学上,与GST蛋白免疫兔体对照组相比,攻击的雌蜱饱血程度和产卵重量都有明显下降,但该重组蛋白对宿主动物可能产生一定的副作用。因此,尽管TBC1D13基因对青海血蜱的存活机制很关键,但是否可作为疫苗候选抗原对蜱进行防控,其生物安全性还需要在兔体模型和其他实验动物模型上进行进一步的评估。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章 文献综述  11-21
  1 蜱防控制剂的研究进展  11-21
    1.1 硬蜱对抗不利外界环境的免疫调控  11-13
    1.2 虫生真菌植物性杀虫剂联合运用的生物防治模式  13
    1.3 昆虫和硬蜱繁殖生理行为的神经内分泌调控  13-17
    1.4 硬蜱化药杀虫剂靶标的研究概况  17-20
    1.5 目的和意义  20-21
第二章 实验材料和方法  21-29
  2.1 实验材料  21
    2.1.1 实验所用动物  21
    2.1.2 试验所用主要试剂及仪器,设备  21
  2.2 实验方法  21-29
    2.2.1 长角血蜱卵cDNA表达文库的免疫学筛选及序列分析  21-23
    2.2.2 半饱血长角血蜱和青海血蜱不同组织的收集及RNA的抽提  23-24
    2.2.3 mRNA的纯化  24
    2.2.4 RACE一链cDNA的制备和扩增  24-25
    2.2.5 生物信息学分析  25
    2.2.6 氨基酸序列的比对和遗传发育树的构建  25
    2.2.7 蜱源基因在不同发育阶段和不同组织的实时定量RT-PCR检测  25-26
    2.2.8 蜱源蛋白的原核表达  26
    2.2.9 MagneGST~(TM)小量蛋白纯化系统的纯化  26-27
    2.2.10 重组蜱源蛋白的大量纯化  27
    2.2.11 融合蛋白的SDS-PAGE检测和Western Blotting检测  27
    2.2.12 免疫和攻蜱感染  27-29
第三章 蜱源基因的克隆  29-37
  3.1 实验结果  29-32
    3.1.1 蜱源基因的克隆  29-30
    3.1.2 部分获得基因的遗传发育树构建  30-32
  3.2 讨论  32-37
第四章 长角血蜱核糖体蛋白HLL24的克隆及定性  37-46
  4.1 实验结果  37-43
    4.1.1 HLL24核酸序列和氨基酸序列的生物信息学分析  37-39
    4.1.2 各物种核糖体蛋白L24 Trash保守结构域的预测及比较  39
    4.1.3 HLL24二级结构预测  39
    4.1.4 已知核糖体蛋白L24的发育遗传分析  39-41
    4.1.5 HLL24在不同组织和不同发育阶段的表达分析  41-42
    4.1.6 HLL24的体外重组表达及大量纯化  42-43
    4.1.7 重组HLL24的抗蜱免疫效应  43
  4.2 讨论  43-46
第五章 长角血蜱内质网Hsp70基因的鉴定  46-57
  5.1 实验结果  46-54
    5.1.1 核酸序列和生物信息学分析  46-50
    5.1.2 长角血蜱Hsp70基因二级结构预测  50
    5.1.3 发育遗传分析  50-51
    5.1.4 长角血蜱卵冷热应激处理后的Hsp70的表达分析  51-52
    5.1.5 Hsp70在长角血蜱不同组织和不同发育阶段的表达  52-53
    5.1.6 Hsp70的体外表达和纯化  53
    5.1.7 长角血蜱Hsp70的免疫原性和天然蛋白的检测  53-54
    5.1.8 长角血蜱Hsp70蛋白对长角血蜱的生理行为的影响  54
  5.2 讨论  54-57
第六章 青海血蜱TBC1D13基因的克隆及定性  57-66
  6.1 实验结果  57-63
    6.1.1 TBC1D13基因的生物信息学分析  57-59
    6.1.2 青海血蜱TBC1D13二级结构预测  59
    6.1.3 发育遗传分析  59-60
    6.1.4 青海血蜱TBC1D13基因在叮咬吸血4d的半饱血雌性成蜱不同组织的表达水平  60-61
    6.1.5 重组青海血蜱TBC1D13基因部分阅读框的表达纯化和蜱唾液腺天然TBC1D13蛋白的检测  61-62
    6.1.6 重组TBC1D13蛋白免疫兔体后抗体水平的动态检测  62-63
    6.1.7 抗蜱免疫保护效应和对兔体模型的副作用观察  63
  6.2 讨论  63-66
第七章 全文结论  66-67
  7.1 结论一  66
  7.2 结论二  66
  7.3 结论三  66
  7.4 结论四  66-67
参考文献  67-82
致谢  82-83
作者简历  83-84
附录  84-87

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医寄生虫病学
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