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牛蒡寡糖脂质体的制备鉴定以及人α1，6岩藻糖基转移酶的初步研究

作　者: 郜海涛
导　师: 王鹏
学　校: 山东大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 牛蒡寡糖(BOS) 脂质体 α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6 FucT,FUT8) 大肠杆菌表达体系 毕赤酵母表达体系 体外表达体系
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


第一部分的研究内容为牛蒡寡糖脂质体的制备和鉴定,主要分为牛蒡寡糖含量测定方法的建立、牛蒡寡糖脂质体制备工艺及处方研究以及牛蒡寡糖脂质体理化性质鉴定三个方面的内容。实验目的：建立计算牛蒡寡糖脂质体的包封率的方法,优化制备牛蒡寡糖脂质体的配方,并对制备好的脂质体进行理化性质和稳定性的研究。实验方法：建立葡萄糖浓度测定的标准曲线,通过计算葡萄糖和牛蒡寡糖之间的换算因子来达到对游离牛蒡寡糖的测定,从而实现牛蒡寡糖脂质体包封率的计算；继而选用药脂比、有机相和水相比例以及磷脂和胆固醇比为考察因素,以包封率为主要考察指标设计正交实验来优化制备处方,并另行考察高压均质条件的优化,以此来优化牛蒡寡糖脂质体的制备方案；再对制备好的牛蒡寡糖脂质体进行理化性质和稳定性研究,包括形态的观察、粒径的测定、zeta电势的测定、通过包封率的测定研究不同储存条件下的稳定性等。实验结果：葡萄糖浓度测定的标准曲线为y=12.4051x+0.01428(R=0.99962),线性范围为0.005-0.15mg/ml。牛蒡寡糖溶液的换算因子f为1.28。通过截留分子量为30KD的超滤离心管可以对牛蒡寡糖和脂质体进行很好的分离。牛蒡寡糖脂质体制备最优方法为薄膜分散法；制备最优条件为：药脂比1：6,有机相和水相体积比1：2,卵磷脂和胆固醇质量比4：1；高压均质最优条件为：压力800bar,循环数3。制备好的牛蒡寡糖脂质为粒径均匀的球状或近球状小囊泡,平均粒径为74.2nm,多相分散系数为0.582,用微电泳仪测得其zeta电势为-12.56mv,通过测定在常温和4低温保存下渗透率的变化确定在4下保存具有较好的稳定性。但稳定性仍有待改善。结论：实验中成功制备牛蒡寡糖脂质体,并对制备工艺、处方以及理化性质和稳定性作出了研究,该脂质体性质比较稳定,大小均匀,具有较高的包封率,可进行细胞学和动物活体实验,为其临床及后续应用奠定了基础。第二部分的研究内容为可溶性的人α-1,6岩藻糖基转移酶(a-1,6 FucT,FUT8)以及对抗该酶的多克隆抗体的初步研究。实验目的：运用三种不同的方法来表达可溶性的α-1,6岩藻糖基转移酶,以用于下游糖蛋白的合成,并为该酶催化和反应机制的研究提供底物支持。制备抗FUT8的多抗,为今后开发癌症的血清学诊断试剂打下基础。实验方法：本论文首先从人胃癌细胞MKN45细胞株中扩增出FUT8的cDNA,构建pET28a-sFUT8载体,转化至大肠杆菌(E. coli)进行大量表达。之后对表达得到的包涵体蛋白进行纯化、变性和复性研究,以纯化后的包涵体为免疫抗原四次免疫小鼠,制备多克隆抗体,并测定其效价。鉴于原核表达无可溶性目的蛋白获得,实验中又尝试了巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和体外试剂盒表达a-1,6岩藻糖基转移酶,实验将FUT8基因(FUT8)克隆到pPIC9k质粒上,电转化入Pichia pastoris GS115菌株,筛选获得高拷贝的重组菌株,甲醇诱导表达FUT8。同时,我们将构建的pET28a-sFUT8载体利用试剂盒在体外进行转录和翻译,利用SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达情况。实验结果：实验从MKN45细胞株中成功扩增得到FUT8的cDNA,并成功构建pET28a-sFUT8原核载体,原核表达获得FUT8的包涵体蛋白。我们利用纯化后的包涵体进行了多抗制备,得到效价在1：5000至1：10000之间的抗FUT8多抗,为癌症的血清学诊断试剂研究打下了基础。同时我们成功构建pPIC9k-FUT8真核表达载体,可溶性FUT8蛋白在毕赤酵母中成功表达。另外,pET28a-sFUT8载体在体外成功表达,得到了可溶性的FUT8蛋白,SDS-PAGE和Western Blot都验证蛋白成功表达。结论：本实验室成功构建了pET28a-sFUT8原核载体和pPIC9k-FUT8真核载体,并将其分别转化至大肠杆菌和毕赤酵母内进行表达,得到的FUT8目的蛋白。原核表达得到包涵体蛋白,真核表达和试剂盒体外表达都得到少量的可溶性FUT8蛋白,表达得到的可溶性α-1,6岩藻糖基转移酶可用于下游糖蛋白的合成,并为该酶催化和反应机制的研究提供底物支持。另外,实验中对抗FUT8的多克隆抗体进行了初步研究,为今后开发鉴别癌症的血清学诊断试剂打下基础。

全文目录


中文摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
符号说明  15-19
第一部分 牛蒡寡糖脂质体的制备和鉴定  19-51
  第一章 前言  19-35
    1.1 脂质体简介  19-23
      1.1.1 脂质体的结构和形成机理  19-21
      1.1.2 脂质体的特点和分类  21-22
      1.1.3 脂质体的作用机制  22-23
    1.2 脂质体的研究进展  23-30
      1.2.1 脂质体制备方法的研究进展  23-25
      1.2.2 新型脂质体  25-27
      1.2.3 脂质体的应用  27-30
    1.3 脂质体的质量评价  30-32
      1.3.1 脂质体的物理性质  30-32
      1.3.2 脂质体的稳定性  32
    1.4 展望  32-33
    1.5 牛蒡寡糖及其研究进展  33-34
    1.6 选题的依据及研究内容  34-35
  第二章 实验器材和材料  35
    2.1 实验器材  35
    2.2 实验材料  35
  第三章 实验方法  35-40
    3.1 牛蒡寡糖含量的测定  35-37
      3.1.1 测定波长的确定  36
      3.1.2 标准曲线的制作  36
      3.1.3 回收率和精密度试验  36
      3.1.4 换算因子的计算  36
      3.1.5 超滤-分光光度法测定包封率的可行性分析实验  36-37
    3.2 牛蒡寡糖脂质体的制备和条件优化  37-39
      3.2.1 制备工艺的选择优化  37-38
      3.2.2 脂质体制备条件优化  38
      3.2.3 高压均质条件的优化  38-39
    3.3 牛蒡寡糖脂质体的理化性质研究  39-40
      3.3.1 牛蒡寡糖脂质体的形态观察  39
      3.3.2 Zeta电势测定  39
      3.3.3 脂质体粒径与粒度分布研究  39
      3.3.4 脂质体稳定性研究实验  39-40
  第四章 实验结果和讨论  40-50
    4.1 实验结果  40-47
      4.1.1 标准曲线的制作  40-42
      4.1.2 牛蒡寡糖脂质体的制备和条件优化  42-45
      4.1.3 牛蒡寡糖脂质体的理化性质研究  45-47
    4.2 讨论  47-50
      4.2.1 牛蒡寡糖脂质体制备可行性的理论讨论  47-48
      4.2.2 牛蒡寡糖脂质体制备方法选择  48
      4.2.3 制备条件的筛选  48-49
      4.2.4 包封率测定方法的选择  49
      4.2.5 脂质体的稳定性讨论  49-50
  第五章 小结  50
  第六章 存在的问题和建议  50-51
第二部分 肿瘤相关人α-1,6岩藻糖基转移酶的初步研究  51-107
  第一章 前言  51-71
    1.1 糖基转移酶介绍  51-55
      1.1.1 糖基转移酶的分类及机理  51-52
      1.1.2 糖基转移酶的结构和功能  52-54
      1.1.3 糖基转移酶的学术趋势  54-55
    1.2 α-1,6岩藻糖基转移酶介绍  55-65
      1.2.1 人α-1,6 FucT基因(FUT8)  56-58
      1.2.2 α-1,6 FucT蛋白的结构特点  58-61
      1.2.3 α-1,6 FucT的底物  61
      1.2.4 α-1,6 FucT的研究现状  61-65
    1.3. 常见的表达系统介绍  65-70
      1.3.1 大肠杆菌表达系统  66-68
      1.3.2 毕赤酵母表达体系  68-69
      1.3.3 试剂盒体外表达系统  69-70
    1.4 选题的依据及研究内容  70-71
  第二章 实验材料与仪器  71-77
    2.1 实验材料  71-74
      2.1.1 实验所用动物、细胞、载体和菌株  71
      2.1.2 培养基和溶液  71-74
    2.2 实验所用试剂与耗材  74-75
    2.3 实验仪器  75-77
  第三章 实验方法  77-95
    3.1 MKN-45细胞系的复苏、培养及冻存  77
    3.2 细胞总RNA的提取与检测  77-79
      3.2.1 Biozol法提取总RNA  77-78
      3.2.2 琼糖凝胶电泳检测总RNA  78-79
    3.3 FUT8 DNA的克隆与鉴定  79-80
      3.3.1 引物设计  79
      3.3.2 mRNA的逆转录  79-80
    3.4 FUT8在大肠杆菌中的表达与多抗制备  80-88
      3.4.1 全长FUT8基因的克隆  80
      3.4.2 FUT8与pEASY-T1载体的连接及大肠杆菌的转化  80-81
      3.4.3 pEASY-T1-FUT8重组质粒的筛选和鉴定  81
      3.4.4 原核表达载体的构建  81-84
      3.4.5 FUT8在大肠杆菌DE3和Rosetta中诱导表达及条件优化  84-85
      3.4.6 包涵体的大量制备及纯化  85-86
      3.4.7 多克隆抗体的制备  86-87
      3.4.8 多抗性质鉴定  87-88
    3.5 FUT8在巴斯德毕赤氏酵母中的表达  88-93
      3.5.1 目的基因的扩增  88-89
      3.5.2 pPIC9K质粒的提取  89
      3.5.3 pPIC9K-FUT 8重组质粒的构建  89-90
      3.5.4 重组质粒线性化  90
      3.5.5 毕赤酵母电转化感受态细胞的制备  90-91
      3.5.6 毕赤酵母的电转化  91
      3.5.7 毕赤酵母重组转化子的筛选  91-92
      3.5.8 重组毕赤酵母菌株的表达  92
      3.5.9 发酵液的浓缩处理  92-93
      3.5.10 Western-Blot检测目的蛋白的表达  93
    3.6 FUT8的体外表达  93-95
      3.6.1 重组质粒处理  93
      3.6.2 重组质粒的体外转录和翻译  93-94
      3.6.3 SDS-PAGE和Western Blot分析  94-95
  第四章 结果与讨论  95-106
    4.1 实验结果  95-104
      4.1.1 总RNA提取后电泳及其浓度计算结果  95-96
      4.1.2 FUT8和sFUT8的克隆与鉴定  96
      4.1.3 FUT8在大肠杆菌中的表达与多抗制备  96-100
      4.1.4 FUT8在巴斯德毕赤氏酵母中的表达  100-103
      4.1.5 FUT8的体外表达及Western-Blot检测  103-104
    4.2 讨论  104-106
      4.2.1 sFUT8基因片段的选择与原核表达的构想  104
      4.2.2 原核表达E coli菌株的选择  104
      4.2.3 原核表达形成包涵体的原因分析  104-105
      4.2.4 小鼠免疫与多抗的产生  105-106
  第五章 小结  106
  第六章 存在的问题和建议  106-107
附录  107-109
参考文献  109-121
致谢  121-122
攻读学位期间将要和参与发表的学术论文  122-123
学位论文评阅及答辩情况表  123

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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