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酪氨酸酶七肽抑制剂的筛选及其柔性脂质体的制备

作　者: 汪雯
导　师: 朱利民
学　校: 东华大学
专　业: 生物化工
关键词: 酪氨酸酶抑制剂噬菌体表面展示抑制机理脂质体透皮吸收
分类号: TQ464.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

酪氨酸酶(EC1.14.18.1)又称多酚氧化酶,是一种含铜金属酶,广泛存在于微生物,昆虫,植物及哺乳动物中,不同来源的酪氨酸酶具有相似的结构和性质。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶。因此,研究能抑制酪氨酸酶活性的物质成为治疗色素沉着性疾病的重要手段。酪氨酸酶抑制剂还可以应用于美白化妆品,生物杀虫剂,果蔬保鲜等众多领域。目前,对酪氨酸酶抑制剂的研究已成为热点研究领域之一。本论文从展示在噬菌体表面的随机肽库中筛选出了一种酪氨酸酶抑制剂,对其进行了抑制动力学研究,探讨了抑制机理。制备了合适的载药体系对该抑制剂进行了包裹,研究了其透皮性能。论文主要内容包括：利用噬菌体表面展示技术,以酪氨酸酶分子为靶分子,经过三轮生物淘洗过程,获得了10个对酪氨酸酶有特异性亲和力的单克隆。对单克隆进行扩增和滴度测试后,通过ELISA测试,测定亲和力最高的为3号克隆。扩增该单克隆提取质粒后进行测序,编码基因作为病毒基因组中的一部分通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。该单克隆的序列为：Ile-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe(7AAP)。即展示在噬菌体颗粒表面,与酪氨酸酶分子亲和性最强的是该序列的七肽。采用酶动力学方法,分别以L-酪氨酸和L-多巴为底物,验证了7AAP对于酪氨酸酶活性的抑制作用。结果显示7AAP对酪氨酸酶具有明显的抑制作用,可抑制酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活力。对酪氨酸酶单酚酶的抑制效应主要表现于酶催化反应的延滞时间有明显的延长,Lineweaver-Burk图显示7AAP对二酚酶的抑制作用表现为可逆竞争性抑制。以人A375黑色素瘤细胞为受试细胞,设置不同的7AAP浓度(0,4.5,9.0,18.0,36.0,72.0,144.0,288.0,576.0,1152.0μmol/L),探讨7AAP对A375黑色素瘤细胞的形态,增殖活性,黑素合成以及酪氨酸酶活性的影响。显微镜下观察,与对照组相比,7AAP对A375黑色素瘤细胞的形态无影响,浓度低于72μmol/L时,对人A375黑色素瘤细胞增殖无明显影响。在4.5-72μmol/L浓度范围内,呈浓度依赖性抑制黑色素瘤细胞黑素生成。为探讨这种黑素生成抑制作用是否与酪氨酸酶有关,进一步检测了7AAP对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响,结果显示,与黑素生成抑制作用相似,在4.5-72μmol/L浓度范围内,7AAP呈浓度依赖性抑制酪氨酸酶活性。结果表明在4.5-72μmol/L浓度范围内,7AAP具有抑制黑素细胞合成和酪氨酸酶活性的功能,而不是依靠降低细胞增殖率而减少相对黑素的含量。对7AAP应用于经皮给药系统进行了初步探索,以大豆卵磷脂,胆固醇为原料,采用逆相蒸发法、薄膜分散法、薄膜超声法三种方法制备了载7AAP纳米脂质体。对其进行了粒径,Zeta电位,回收率,包封率的测定等表征。动态光散射的结果显示,由逆向蒸发法制备的脂质体粒径分布最均匀,范围较窄。场发射扫描电镜下观察,脂质体呈白色球状或椭球状,绝大部分为单室脂质体。采用逆向蒸发法,分别以磷脂：胆酸钠(W：W)=6：1,8：1,10：1为配方,制备柔性纳米脂质体,观察脱氧胆酸钠对于脂质体变形性的影响。其中7AAP溶液透过皮肤的速率最快,而三种剂型的7AAP脂质体的累积渗透量均较溶液小,仅为7AAP溶液的1/3。这表明脂质体制剂对于减少药物进入体循环有益。相比普通脂质体,三种剂型的柔性脂质体不仅具有较高的透皮能力,还具有较高的皮肤内滞留量。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章绪论  13-32
  1.1 酪氨酸酶的研究概况  13-14
  1.2 酪氨酸酶抑制剂的研究概况  14-17
    1.2.1 酪氨酸酶抑制剂的主要来源  14-16
    1.2.2 酪氨酸酶抑制剂的应用  16-17
  1.3 噬菌体表面展示技术简介及应用  17-22
    1.3.1 抗原表位分析与新型疫苗开发中的应用  18-19
    1.3.2 在抗体工程中的应用  19-21
    1.3.3 在筛选多肽类药物和酶抑制剂中的应用  21-22
  1.4 脂质体的研究概况  22-30
    1.4.1 脂质体的分类  22-23
    1.4.2 脂质体的制备方法  23-24
    1.4.3 脂质体在载药系统中的应用  24-27
    1.4.4 脂质体技术在化妆品制剂中的应用  27-30
  1.5 本课题研究的目的及意义  30-32
第二章噬菌体表面展示技术筛选酪氨酸酶抑制剂  32-43
  2.1 引言  32
  2.2 实验部分  32-34
    2.2.1 原料与试剂  32
    2.2.2 主要仪器  32-34
    2.2.3 主要培养基和溶液的配置  34
  2.3 实验方法  34-39
    2.3.1 靶分子的包被  34-35
    2.3.2 宿主菌ER 2738的活化及生长曲线的绘制  35
    2.3.3 第一轮淘洗程序  35-36
    2.3.4 第一轮洗脱物的滴度测试  36
    2.3.5 第一轮洗脱物的扩增  36-37
    2.3.6 第一轮扩增物的滴度测试  37
    2.3.7 第二,三轮淘洗程序  37
    2.3.8 噬菌斑的扩增  37-38
    2.3.9 ELISA鉴定重组噬菌体对靶分子的结合  38
    2.3.10 DNA测序  38-39
  2.4 结果与讨论  39-42
    2.4.1 酪氨酸酶分子特异性结合的噬菌体的富集  39-40
    2.4.2 ELISA鉴定重组噬菌体对酪氨酸酶分子的亲和力  40-41
    2.4.3 酪氨酸酶分子高亲和力噬菌体外源多肽序列的测定  41-42
  2.5 本章小结  42-43
第三章 7AAP对酪氨酸酶抑制动力学及对体外黑素细胞的生物学效应研究  43-56
  3.1 引言  43
  3.2 材料与方法  43-44
    3.2.1 原料与试剂  43-44
    3.2.2 主要仪器  44
  3.3 实验方法  44-47
    3.3.1 酪氨酸酶酶液的制备及其活力测定  44-45
    3.3.2 抑制酪氨酸酶活性动力学分析  45
    3.3.3 7AAP对A375黑色素瘤细胞黑素生成的影响  45-47
  3.4 结果与讨论  47-55
    3.4.1 7AAP对酪氨酸酶单酚酶的影响  47-48
    3.4.2 7AAP对酪氨酸酶二酚酶的影响  48-50
    3.4.3 7AAP对酪氨酸酶二酚酶抑制作用机理  50-51
    3.4.4 7AAP对酪氨酸酶二酚酶抑制作用动力学分析  51-53
    3.4.5 7AAP对黑素细胞增殖活性的影响  53-54
    3.4.6 7AAP对黑色素瘤细胞黑素生成和酪氨酸酶活性的影响  54-55
  3.5 本章小结  55-56
第四章载7AAP柔性纳米脂质体的制备及其物理化学性质的研究  56-71
  4.1 引言  56
  4.2 实验材料及仪器  56
    4.2.1 原料与试剂  56
    4.2.2 主要仪器  56
  4.3 实验方法  56-61
    4.3.1 7AAP脂质体的制备  56-58
    4.3.2 游离药物与脂质体的分离及包封率的测定  58-59
    4.3.3 脂质体物理性质的表征  59-60
    4.3.4 透皮扩散实验  60-61
  4.4 结果与讨论  61-69
    4.4.1 Zeta电位  61
    4.4.2 不同制备方法对7AAP脂质体粒径的影响  61-63
    4.4.3 7AAP脂质体回收率,包封率的测定结果  63-66
    4.4.4 不同浓度表面活性剂对脂质体变形性的影响  66-69
  4.5 本章小结  69-71
第五章结论与展望  71-73
参考文献  73-83
硕士期间发表的学术论文及专利申请情况  83-85
致谢  85

酪氨酸酶七肽抑制剂的筛选及其柔性脂质体的制备

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