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仿生细胞膜技术研究中药活性成分

作　者: 陈晓萍
导　师: 梁建英
学　校: 复旦大学
专　业: 药物分析学
关键词: 中药活性成分荧光脂质体红细胞膜心肌细胞膜金银花丹参高效液相色谱法超滤生物膜通透性
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

中药的活性成分研究一直是一个重要的研究方向。传统的中药研究方法是通过提取中药中单一成分或制备提取物进行药理实验确定有效成分,这种方法步骤繁琐,劳动强度高,且成功的概率低。近年来高通量筛选被应用于中药活性成分筛选中,可以大大减少活性筛选周期并节省试样量。药物的活性已被证明与其生物膜通透性有关,脂质体因与生物膜具有类似结构常用于模拟生物膜研究药物的生物膜通透性。在第一章中,我们建立了荧光脂质体模型并将其应用于评估中药单体的生物膜通透性,借此预测中药的活性成分。其基本原理如下：用两种常用的荧光探针DPH、TMA-DPH标记脂质体,中药单体进入荧光脂质体中,聚集在荧光探针周围,将对荧光探针造成荧光淬灭,通过测定与中药单体作用前后荧光脂质体的荧光强度,计算荧光淬灭率,借此推断中药单体进入脂质体的量,预测中药单体的生物膜通透性。为了验证上述荧光脂质体模型用于预测中药单体的生物膜通透性的可行性,在第二章中,用荧光探针DPH标记红细胞膜,用中药单体引起的红细胞膜荧光淬灭率来评估中药单体的细胞膜通透性,并与第一章中建立的荧光脂质体模型比较,发现二者的相关性很好,相关系数为0.93,说明本研究所提出的用荧光脂质体考察中药单体的生物膜通透性是可行的。上述荧光脂质体模型可以实现对中药单体的快速、准确、高通量的筛选,但是仍存在局限性。中药具有多组分、多靶点的作用特性,它所体现的疗效是整体作用的结果,因此需要将它视为一个整体进行研究。因此,在第三章中,我们建立了一种全新的利用脂质体模拟生物膜筛选中药中生物膜通透性成分的研究模式,以中药提取物为对象,采用高效液相色谱技术,分析比较中药提取物与脂质体作用前后的色谱图,根据色谱图中组分峰面积的变化情况判断药物与脂质体的作用程度,峰面积减少越多显示此种组分进入脂质体中的量越多,由此从中筛选出能与脂质体结合的组分,预测中药的活性成分。我们将上述研究模式应用于药效基础研究比较深入的金银花的研究中,鉴定出8个能与脂质体结合的成分(绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮素、木犀草素),这些成分都是已知的金银花中的主要活性成分,说明所建立的脂质体模型可初步筛选中药的活性成分。在最后一章中,我们应用第三章所提出的筛选模式进行丹参的生物膜通透性成分的研究,鉴定出12个能与脂质体相互作用的成分(丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、香草酸、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA),即生物膜通透性成分,除了香草酸,其他成分都是已验证且公认的丹参中的主要活性成分；此外,还研究了丹参与真实细胞膜如红细胞膜、心肌细胞膜的相互作用,发现丹参中与脂质体有相互作用的12个成分也与红细胞膜作用明显,且脂质体与红细胞膜的相关性良好,相关系数为0.9059,进一步说明用脂质体来研究丹参提取物中的生物膜通透性成分是可行的。可与心肌细胞膜结合的成分有二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA,这可为揭示丹参的心血管药效基础提供依据。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-12
第一章中药单体对荧光脂质体的影响  12-25
  1.1 引言  12
  1.2 仪器和试药  12-16
  1.3 荧光脂质体模型的建立  16-18
  1.4 中药单体与荧光脂质体的相互作用  18-24
    1.4.1 实验方法  18
    1.4.2 结果与讨论  18-24
      1.4.2.1 荧光脂质体预测中药单体生物膜通透性的原理  18
      1.4.2.2 中药单体与荧光脂质体作用时间的选择  18-19
      1.4.2.3 不同浓度的中药单体对荧光脂质体的影响  19-22
      1.4.2.4 中药单体对DPH、TMA-DPH荧光脂质体的影响  22-24
  1.5 本章小结  24-25
第二章中药单体对荧光红细胞膜的影响  25-32
  2.1 引言  25
  2.2 仪器和试药  25-26
  2.3 实验方法  26-27
    2.3.1 荧光红细胞膜的制备  26
    2.3.2 荧光红细胞膜的考察  26
    2.3.3 中药单体与荧光红细胞膜的相互作用  26-27
  2.4 结果与讨论  27-31
    2.4.1 荧光红细胞膜的考察结果  27-28
    2.4.2 不同浓度中药单体对荧光红细胞膜的影响  28-29
    2.4.3 中药单体对荧光红细胞膜的影响  29-30
    2.4.4 荧光脂质体和荧光红细胞膜的相关性  30-31
  2.5 本章小结  31-32
第三章金银花与脂质体模拟生物膜的相互作用  32-47
  3.1 引言  32
  3.2 仪器及试药  32-33
  3.3 HPLC-DAD同时测定金银花中8种成分方法的建立  33-34
  3.4 HPLC-DAD分析方法的验证  34-38
    3.4.1 色谱行为  34-36
    3.4.2 线性范围  36
    3.4.3 检测限和定量限  36-37
    3.4.4 精密度  37
    3.4.5 准确度  37-38
    3.4.6 重复性  38
    3.4.7 稳定性试验  38
  3.5 提取方法比较  38-40
  3.6 HPLC-DAD-MS分析方法的优化和讨论  40
  3.7 金银花与脂质体的相互作用  40-45
    3.7.1 实验方法  40-41
    3.7.2 结果与讨论  41-45
      3.7.2.1 超滤回收率  41-42
      3.7.2.2 金银花中与脂质体有结合作用的成分  42-45
      3.7.2.3 不同pH值对金银花与脂质体作用的影响  45
  3.8 本章小结  45-47
第四章丹参与脂质体模拟生物膜的相互作用  47-67
  4.1 引言  47
  4.2 仪器及材料  47-49
  4.3 HPLC-DAD-MS同时测定丹参中14种成分方法的建立  49-51
  4.4 HPLC-DAD-MS分析方法的验证  51-55
    4.4.1 色谱行为  51-52
    4.4.2 线性范围  52
    4.4.3 检测限和定量限  52-53
    4.4.4 精密度  53
    4.4.5 重复性  53
    4.4.6 稳定性  53-54
    4.4.7 准确度  54-55
  4.5 HPLC-DAD-MS分析方法的优化和讨论  55-56
  4.6 丹参与脂质体的相互作用  56-61
    4.6.1 实验方法  56-57
    4.6.2 结果与讨论  57-61
      4.6.2.1 超滤回收率  57-58
      4.6.2.2 丹参中与脂质体有结合作用的成分  58-61
      4.6.2.3 不同pH值对丹参与脂质体作用的影响  61
      4.6.2.4 丹参中各中药单体及提取物中组分与脂质体的相互作用比较  61
  4.7 丹参与红细胞膜的相互作用  61-64
    4.7.1 实验方法  61-62
    4.7.2 结果与讨论  62-64
      4.7.2.1 丹参中与红细胞膜有结合作用的成分  62-63
      4.7.2.2 脂质体与红细胞膜的相关性  63-64
  4.8 丹参与心肌细胞膜的相互作用  64-65
    4.8.1 实验方法  64
    4.8.2 结果与讨论  64-65
  4.9 本章小结  65-67
全文总结  67-68
参考文献  68-72
附录Ⅰ 生物色谱法在中药活性成分筛选中的应用  72-78
  参考文献  76-78
附录Ⅱ 在校期间发表论文情况  78-79
致谢  79-80

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