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大鼠血浆中河豚毒素的定量检测研究

作　者: 郑雍怡
导　师: 阎超
学　校: 上海交通大学
专　业: 药物分析学
关键词: 河豚毒素 大鼠血浆 定量检测 高效液相色谱 加压毛细管电色谱 液-质联用
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


河豚鱼,属于鱼纲（Pisccs）硬骨亚纲（Osrteicfhuys）,豚形目（Tetrodonlitormes）。目前,全世界发现的河豚已有100来种,其中60%带有致命的毒性。它的最毒部位是卵巢、肠和肝脏。河豚鱼体内的有毒物质就是河豚毒素（Tetrodotoxin, TTX）,其毒力比氰化物还要强1250倍。每年,我国都有人因为误食河豚鱼而中毒身亡。另一方面,TTX有一定的药用和经济价值。通过国内外大量研究证明,TTX具有镇痛、局麻、解痉等多方面的药理作用,尤其对多种钝痛及锐痛具有明显的缓解作用。而且,因为TTX是通过攻击向大脑传导疼痛信号的神经细胞来起到镇痛作用,所以可取代化学药物和中草药戒毒,患者不会成瘾。可见,TTX进入临床广泛使用已经指日可待。在这些背景下,寻找科学准确的TTX质检方法和血浆中TTX的检测方法已经刻不容缓。目前为止,国际和国内研究者的研究重心都是在TTX标准品的检测和河豚鱼组织中TTX的提取上。本文除了利用现代分析仪器如HPLC、pCEC和LC-MS探讨TTX标准品的分析方法,为TTX生产的质检工作提供参考,同时也利用HPLC、LC-MS建立了TTX血浆样品检测方法,并首次利用LC-MS对TTX在大鼠体内的血药浓度变化进行监测。本文包括以下几方面的内容:第一章为文献综述,介绍了河豚毒素的化学结构,理化性质,中毒机理,临床应用,检测方法等。第二章中,利用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）、加压毛细管电色谱（pCEC）和液-质联用（LC-MS）三种现代分析方法对TTX标准品进行分析检测。结果可知,这三种分析方法的TTX检测限分别是0.25μg·mL-1（5 ng）,0.1μg·mL-1（1.2 pg）和0.5 ng·mL-1（5 pg）。第三章建立了大鼠血浆中TTX的反相离子对高效液相色谱-紫外检测法。根据TTX的化学特点,采用酸性条件下乙腈和甲醇联用（乙腈-含0.5%HAc的甲醇液=3:1）来沉淀蛋白,并以庚烷磺酸钠为离子对试剂,采用反相离子对高效液相色谱分离提取TTX血浆样品,克服了TTX在反相柱上保留弱的缺点,并很好地与血浆中内源性杂质相分离,达到了定量检测的目的。TTX在血浆中的线性范围为21.1221μg·mL-1（r2=0.9989）。血浆中TTX的检测限为10.55μg·mL-1,即211 ng。该法准确、专属性好、精密度高,适用于血浆中TTX的含量测定。第四章,用LC-MS法建立了大鼠血浆中TTX的检测方法,并应用该法对单剂量腹腔给药后的大鼠体内TTX浓度变化进行监测。在实验方法上,延续了上述的沉淀蛋白法,为了提高TTX的检测限,增加冻干步骤以达到浓缩目的,取得了比较好的效果。TTX在血浆中的线性范围为1.75842.2 ng·mL-1（r2=0.9993）。血浆中TTX的检测限为1.758 ng·mL-1 （S/N=3）,即17.58 pg。该法准确、精密度好、灵敏度高,适用于血浆中TTX的含量测定。将建立的检测方法应用于研究大鼠体内TTX的药-时变化,得到TTX在大鼠体内4 h的血药浓度-时间曲线。可以看到,TTX腹腔注射吸收较快。在所考察的5只大鼠中,单剂量给药1μg后5 min,在血浆中便已检测到TTX的样品峰,约30 min后,达到血药浓度峰值,即6.564 ng·mL-1。第五章对本研究的创新性进行了总结,并对未来的研究前景进行了展望。

全文目录


摘要  6-9
ABSTRACT  9-19
第一章 河豚毒素综述  19-33
  1.1 河豚  19-20
  1.2 河豚毒素  20-31
    1.2.1 河豚毒素的化学结构及其理化性质  20-22
    1.2.2 河豚毒素在自然界的分布  22-23
    1.2.3 河豚毒素的中毒机理  23-24
    1.2.4 河豚鱼市场管理  24
    1.2.5 河豚毒素的临床应用  24-25
    1.2.6 河豚毒素的检测方法  25-31
  1.3 展望与论文研究工作  31-33
第二章 河豚毒素标准品的定量检测  33-54
  2.1 仪器与试剂  35-36
    2.1.1 主要仪器设备  35
    2.1.2 主要试剂  35-36
  2.2 实验方法  36-38
    2.2.1 HPLC-UV  36
    2.2.2 加压毛细管电色谱  36
    2.2.3 LC-MS  36-38
  2.3 结果与讨论  38-53
    2.3.1 HPLC-UV 检测TTX  38-44
    2.3.2 加压毛细管电色谱检测 TTX  44-47
    2.3.3 LC-MS 检测TTX  47-53
  2.4 小结  53-54
第三章 HPLC-UV 法测定大鼠血浆中河豚毒素的含量  54-77
  3.1 仪器与试剂  54-55
    3.1.1 主要仪器设备  54-55
    3.1.2 主要试剂  55
  3.2 实验方法  55-58
    3.2.1 对照品溶液的制备  55
    3.2.2 血浆样品预处理方法  55-57
    3.2.3 色谱条件  57-58
  3.3 结果与讨论  58-75
    3.3.1 血浆样品预处理  58-64
    3.3.2 流动相的选择  64-69
    3.3.3 分析方法的验证  69-75
  3.4 小结  75-77
第四章 LC-MS 法测定大鼠血浆中河豚毒素  77-94
  4.1 仪器与试剂  77-78
    4.1.1 主要仪器设备  77-78
    4.1.2 主要试剂  78
  4.2 实验动物  78
  4.3 实验方法  78-80
    4.3.1 对照品溶液的制备  78
    4.3.2 血浆样品预处理  78-79
    4.3.3 TTX 药-时曲线的测定  79-80
    4.3.4 LC-MS 条件  80
  4.4 结果与讨论  80-92
    4.4.1 电离电压的选择  80-82
    4.4.2 毛细管电压的选择  82-83
    4.4.3 流动相的选择  83-85
    4.4.4 分析方法的验证  85-92
    4.4.5 TTX 药-时曲线研究结果  92
  4.5 小结  92-94
第五章 结论和展望  94-96
参考文献  96-101
致谢  101-102
攻读学位期间发表的学术论文  102

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