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致倦库蚊三种解毒酶基因的表达及组织定位研究

作　者: 闫亮珍
导　师: 马恩波；崔峰
学　校: 山西大学
专　业: 动物学
关键词: 致倦库蚊原位杂交解毒酶基因系统发育数字基因表达
分类号: Q963
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蚊虫是传播人类多种疾病的重要媒介害虫,如登革热和黄热病、乙型脑炎、疟疾、丝虫病等。对蚊虫进行有效防治以减少蚊媒病的传播和死亡率,一直是世界卫生组织工作重点。目前对蚊虫的防治主要依靠生物防治、化学防治以及环境防治等相结合的综合治理措施。但由于生物防治和化学防治中杀虫剂的广泛使用及滥用,使得蚊虫不仅对杀虫剂产生不同程度抗性,而且也加快了蚊虫体内抗性基因的进化速度。本文以揭示蚊虫抗性机制为主要研究目的,着重从以下几方面对蚊虫体内三大解毒酶家族基因进行研究。第一,P450单加氧酶、谷胱甘肽-S-转移酶与羧酸酯酶做为昆虫抵御外来有毒物质防御系统的重要组成部分,是参与昆虫体内杀虫剂代谢与抗性过程的主要酶。它们在生物体内执行多种功能,如羧酸酯酶的水解功能。其功能多样性取决于其序列的差异性。本文用Mega 3.0聚类软件对致倦库蚊三类酶家族基因分别进行系统进化分类研究,将80条羧酸酯酶基因归类到A-N 14个分类单元；将35条GST归类到Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta、Zeta等6个分类单元；将198条P450序列归类到CYP3、CYP4、CYP6、CYP9、CYP2和线粒体(mitochondrial)5个分类单元。同时得到这些基因的具体分类和进化信息,这不仅有助于对这些基因的功能研究,而且为探索蚊虫抗性机制研究提供理论依据。第二,新一代测序技术的发展壮大,使得低成本、高通量、快速、精确且全面地分析基因转录情况成为可能。本文选用卵、幼虫、蛹、成虫四个不同发育阶段的有机磷抗性蚊虫品系为研究材料,进行体内总RNA表达测序分析与比较,从而筛选出阶段特异性表达基因(其中卵期：1076个；3龄幼虫：545个；蛹：465个；成蚊：580个)和差异性表达基因(幼虫／卵：3217个；蛹／卵：2885个；成蚊／卵：3491个)。为进一步了解这些阶段特异基因和差异表达基因的功能和所参与的代谢途径,我们对这些基因进行详细的GO分析和Pathway富集分析。最后,我们对四个发育阶段80个羧酸酯酶基因、35个GST以及198个P450基因表达情况分别进行监测并构建基因表达谱图。结果发现,仅50个羧酸酯酶基因、29个GST和138个P450基因被监测到有表达。其余基因可能不表达或表达量极低而未被检测到。第三,原位杂交是定位目的基因在生物体内表达部位的经典技术之一。将地高辛标记的核酸探针与石蜡包埋的致倦库蚊组织切片中羧酸酯酶mRNA、谷胱甘肽-S-转移酶nRNA、P450s mRNA信息进行杂交,即可得到这些基因在蚊虫生物体内表达部位。本文采用此技术将羧酸酯酶家族2个代表性基因体内表达明确定位到卵巢、脑、神经节、中肠等部位。这为研究羧酸酯酶基因在生物体内的表达模式、作用部位和抗性机制提供可靠的实验依据。第四,对蚊虫组织形态学的认识是开展众多领域研究的基础。本文采用改进的石蜡切片法和HE染色,结合活体内脏器官解剖及光学显微镜观察,从形态学和组织学水平对致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus组织结构做详尽展示,结果获得了结构完整、染色清晰、定位准确的消化排泄系统、生殖系统、神经系统等HE染色石蜡切片,并探讨了改进制片和染色过程中一些步骤及注意事项。研究结果对利用原位杂交、免疫组化等方法研究蚊虫体内抗药性基因的准确定位及基因功能分析提供了可靠的基础。通过研究致倦库蚊成虫组织结构及形态,为媒介蚊虫的抗药性研究及有效防治提供基础材料。

全文目录

中文摘要  12-14
ABSTRACT  14-17
第一章综述  17-27
  1 蚊虫生活史与其传播的疾病  17
  2 蚊虫的防治及其抗药性  17-18
    2.1 蚊虫的防治  17-18
    2.2 蚊虫的抗药性  18
  3 CCE、GST和P450三大解毒酶家族特点及其抗性机制研究  18-23
    3.1 酯酶家族分类  19
    3.2 酯酶解毒机理  19-20
    3.3 酯酶抗性机制  20-21
    3.4 谷胱甘肽-S-转移酶的分类  21
    3.5 谷胱甘肽-S-转移酶的解毒机理  21
    3.6 谷胱甘肽-S-转移酶的抗性机制  21-22
    3.7 P450基因家族分类、解毒机理与抗性机制  22-23
  4 原位杂交技术原理及其应用  23-25
  5 新一代测序技术:数字基因表达谱的原理与应用  25-26
  6 本文研究目的及意义  26-27
第二章致倦库蚊解毒酶系家族基因的系统分类  27-45
  1 实验材料  27
  2 实验方法  27-28
    2.1 CCE、GST和P450序列下载  27-28
    2.2 致倦库蚊CCE、P450和GST三大家族数字基因表达谱分析  28
  3 实验结果  28-43
    3.1 致倦库蚊解毒酶基因序列下载  28
    3.2 致倦库蚊羧酸酯酶基因家族  28-33
    3.3 致倦库蚊P450基因家族  33-39
    3.4 致倦库蚊谷胱甘肽-S-转移酶家族  39-41
    3.5 CCE、GST和P450三大解毒酶基因家族表达谱  41-43
  4 讨论  43-45
第三章致倦库蚊数字基因表达谱分析  45-55
  1 实验材料  45
  2 实验方法  45-47
    2.1 不同龄期致倦库蚊的收集  45
    2.2 RNA的提取、cDNA合成和tag制备  45-46
    2.3 SOLEXA/Illumina系统测序  46
    2.4 测序结果分析  46-47
      2.4.1 测序质量评估与测序饱和度分析  46
      2.4.2 去除杂质序列产生clean tag及其拷贝数分布统计  46
      2.4.3 标签与参考基因标签数据库比对分析与基因表达注释  46
      2.4.4 差异表达基因筛选  46-47
      2.4.5 差异表达基因聚类分析、GO和pathway分析  47
      2.4.6 新转录本检测  47
      2.4.7 反义链转录分析  47
  3 实验结果  47-53
    3.1 致倦库蚊不同发育阶段样品测序结果  47-48
    3.2 测序质量与测序饱和度分析  48-50
    3.3 表达标签在基因上的分布位置  50
    3.4 差异表达基因识别与发育阶段特异表达基因识别  50
    3.5 差异表达基因GO与pathway分析  50-52
    3.6 阶段特异表达基因GO与pathway分析  52
    3.7 sense-antisense调控与新转录本的发现  52-53
  4 讨论  53-55
第四章致倦库蚊羧酸酯酶基因在蚊虫体内的组织表达  55-67
  1 实验材料  55-57
    1.1 实验主要仪器  55
    1.2 实验试剂及主要试剂配制方法  55-57
    1.3 实验蚊虫  57
  2 实验方法  57-62
    2.1 蚊虫总RNA提取(Trizol法)  57
    2.2 总RNA反转录合成cDNA第一链  57-58
    2.3 羧酸酯酶基因探针模板合成  58-59
    2.4 RNA探针合成  59-60
    2.5 蚊虫的固定与包埋  60-61
    2.6 石蜡切片制作  61
    2.7 原位杂交实验  61-62
  3 实验结果  62-63
    3.1 原位杂交基因的选择  62
    3.2 原位杂交条件与结果  62-63
  4 分析与讨论  63-67
第五章致倦库蚊主要组织结构的石蜡切片观察  67-75
  1 材料与方法  67-68
    1.1 实验材料  67
    1.2 蚊虫的解剖  67
    1.3 蚊虫连续石蜡切片的制备及染色  67-68
      1.3.1 主要试剂及仪器  67-68
      1.3.2 蚊虫的固定  68
      1.3.3 包埋  68
      1.3.4 脱水、透明和浸蜡  68
      1.3.5 切片  68
      1.3.6 HE染色  68
  2 结果  68-72
    2.1 消化排泄系统  70-71
    2.2 生殖系统  71
    2.3 神经系统与感觉器官  71
    2.4 背支囊与腹支囊  71
    2.5 脂肪体  71-72
  3 讨论  72-75
参考文献  75-85
攻读学位期间取得的研究成果  85-86
致谢  86-87
个人简况及联系方式  87-89

致倦库蚊三种解毒酶基因的表达及组织定位研究

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