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猪Tiki基因的初步研究及Tiki1基因打靶载体的构建

作　者: 张翼
导　师: 赖良学；贺熹
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Tiki基因 全胚胎原位杂交 基因打
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本文对猪Tiki基因的表达进行了初步的研究,并成功构建了猪Tiki1基因置换型打靶载体。Tiki基因为哈佛大学儿童医学院贺熹教授的实验室最新发现的基因,在Wnt信号通路中作为抑制因子而发挥作用。Tiki基因包括Tiki1和Tiki2两种,其中Tiki1基因在啮齿类动物(如小鼠和大鼠)的体内缺失。在蛙胚胎早期发育的过程中,Tiki1的原位杂交表明其分布在胚胎体轴的前端,暗示对于体轴前端结构的发育起作用,而在蛙上进行的功能研究实验证实了Tiki1确实在头部诱导的过程中起着决定性的作用,类似于Wnt信号通路中的另一抑制因子DKK-1。但由于小鼠体内缺乏Tiki1基因的表达,使用小鼠作为研究人类Tiki1基因缺失疾病模型的传统途径被阻断,与人类在生理学、病理学上都极为相近的猪成为研究Tiki1功能的理想哺乳动物模型。本实验用PCR的方法在成体猪的肝脏、肺、乳腺和卵巢四种器官中检测到Tiki1基因的表达,在心脏中检测到了Tiki2基因的表达。从上述器官中获取的Tiki1和Tiki2部分cDNA片段测序结果与不同物种的比对显示,我们获取Tiki基因部分片段在不同物种中具有高度同源性(80%以上),说明此基因高度保守,可能具有重要的功能。为了和Tiki基因在蛙和鼠上的表达模式做对比,对12-15天,即原条期到神经沟阶段的猪胚胎进行了全胚胎原位杂交,实验结果显示Tiki1基因在胚胎前端边缘处表达,说明在猪的胚胎发育过程中Tiki1极有可能像在蛙上一样,对头部的诱导起着关键性的作用。在猪胚胎上进行的Tiki2基因的原位杂交结果和Tiki2在鼠胚胎上的原位杂交结果是一致的,均为沿着胚胎的中轴线纵向分布,且信号不强,貌似在胚胎中的表达丰度也不及Tiki1基因。为了进一步地证实猪Tiki1是否具有头部诱导的功能,本实验成功构建了猪Tiki1基因置换型打靶载体并进行了初步的细胞筛选,以期在后续的研究中对Tiki基因在猪胚胎早期发育的过程中的作用做进一步的探索。总之,本文对猪Tiki基因的表达进行了初步的研究,并成功地构建了猪Tiki1基因置换型打靶载体。本实验获得的成果为深入研究Tiki基因在猪胚胎早期发育的过程中的作用奠定了基础。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
第一章 文献综述  9-21
  1.1 Wnt 信号通路和DKK-1  9-11
  1.2 Tiki 基因  11-12
  1.3 猪作为实验动物的研究现状  12-13
  1.4 基因打靶  13-18
    1.4.1 基因打靶的历史回顾  13
    1.4.2 基因打靶的原理和策略  13-16
    1.4.3 基因打靶技术在猪上的应用和发展  16-18
  1.5 猪胚胎的早期发育  18-19
    1.5.1 囊胚的形成  18
    1.5.2 胚盘的形成  18-19
  1.6 全胚胎原位杂交  19-21
第二章 材料和方法  21-49
  2.1 实验材料  21-27
    2.1.1 胚胎  21
    2.1.2 探针  21
    2.1.3 质粒  21
    2.1.4 细胞  21
    2.1.5 菌株  21
    2.1.6 抗体  21
    2.1.7 主要材料  21-22
    2.1.8 主要实验器材  22
    2.1.9 主要试剂的配置  22-26
    2.1.10 主要仪器设备  26-27
  2.2 实验方法  27-49
    2.2.1 猪Tiki1、Tiki2 cDNA 片段的获取及体外转录克隆载体的构建  27-35
    2.2.2 全胚胎原位杂交  35-38
    2.2.3 猪Tiki1 基因打靶载体的构建  38-44
    2.2.4 猪胎儿成纤维细胞的分离和培养  44
    2.2.5 Tiki1 打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞  44-49
第三章 实验结果  49-63
  3.1 猪Tiki1、Tiki2 基因在成体中的表达情况  49-50
  3.2 Tiki1 和Tiki2 cDNA 片段不同物种同源性的比较  50-51
  3.3 体外转录载体的构建  51-52
  3.4 体外转录合成DIG-labelled anti RNA 探针  52-53
  3.5 猪胚胎原位杂交  53-57
  3.6 猪Tiki1 基因打靶载体的构建  57-60
  3.7 Tiki1 打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞的筛选  60-63
第四章 讨论  63-66
第五章 小结  66-67
参考文献  67-74
致谢  74-75

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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