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肺病患者呼吸道真菌的检测及分子鉴定

作　者: 蒋彤
导　师: 郝飞
学　校: 第三军医大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 真菌培养曲霉随机扩增多态性DNA(RAPD) 播散性马尔尼菲青霉病
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

近年来,随着医疗技术的飞速发展,器官移植、有创检查及治疗新技术的不断推广,以及广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用,使各种真菌引起的机会性感染的发病率呈现急剧上升趋势。曲霉和念珠菌作为主要的深部致病真菌,越来越受到国内外学者的关注。曲霉的孢子很小,可以在空气中漂浮,也可以定植在正常人群的鼻腔中。曲霉是条件致病菌,主要通过呼吸道侵入人体而致病,常常发生在有基础疾病尤其是肺部疾病的患者。目前国内外的相关研究关于侵入肺组织内部的曲霉孢子来源于周围环境或是来源于鼻腔定植尚缺乏定论,倾向于与周围环境有关。本研究通过对不同肺病患者呼吸道真菌进行检测,并用随机扩增多态性DNA(RAPD)基因分型方法进行分子鉴定,探讨肺组织内部曲霉孢子的感染来源,为肺部曲霉感染的临床诊断、预防提供流行病学调查的实验依据。本研究对925例肺病患者和100例健康人呼吸道真菌定植及分布情况进行检测,发现呼吸道常见曲霉种类有黄曲霉、黑曲霉和烟曲霉,它们在肺病患者中的总检出率分别为53.8%、41.5%和23.1%,在健康人中的总检出率分别为23.0%、14.0%和1.0%,还有少量的棒曲霉、杂色曲霉和未知曲霉。曲霉在鼻腔定植率较高,其中肺病患者约为68.8%,健康人约为38.0%。虽然曲霉在健康人群和肺病患者的鼻腔中均有定植,但是在肺病患者的鼻腔中曲霉的检出比例远大于健康人群(P<0.01),由此可见,呼吸系统受到各种致病因素的影响后,其对于曲霉及念珠菌定植的抵抗能力明显减弱。在925例肺病患者呼吸道共检出酵母菌399株,其中C.albicans总检出率为18.9%,非白念珠菌总检出率为24.2%;在100例健康人呼吸道共检出酵母菌9株,其中C.albicans总检出率为4.0%,非白念珠菌总检出率为5.0%。酵母菌在咽部的检出率较高,其中肺病患者约为30.4%、健康人约为9.0%。经API 20C AUX系统鉴定的54株酵母菌中,C.albicans所占比例最大,约为32.0%,而咽部C.albicans检出率最高,约占所有C.albicans的70.6%。提示念珠菌在呼吸道的分布形式与曲霉不同,主要以咽部为主,并可以下行至肺组织内部造成内源性念珠菌感染。在269例老年肺病患者中,鼻腔和支气管肺泡灌洗液(BALF)中曲霉检出率分别为77.0%和14.5%;而在656例中青年患者中,鼻腔和BALF中曲霉检出率分别为64.8%和9.6%,结果显示老年患者鼻腔及BALF中曲霉检出率明显高于中青年患者(P<0.05),说明老年肺病患者呼吸道的环境更适合曲霉定植与生长,提示呼吸系统及肺功能的老龄化以及机体抵抗力生理性的缺乏和各脏器功能的明显衰退等与年龄老化相关的各种因素,为呼吸道曲霉的定植提供了更有利的条件。在386例肺部恶性肿瘤患者中,BALF中曲霉检出率为15.0%;而在409例肺结核和肺部细菌感染的患者中,BALF中曲霉检出率为8.3%,结果显示肺部恶性肿瘤患者的BALF中曲霉检出率明显高于患有肺结核和肺部细菌感染等其他呼吸系统疾病的患者(P<0.01),说明呼吸系统恶性肿瘤能够破坏呼吸道的生理性局部屏障防御、降低机体的防御功能,导致机体出现不同程度的免疫缺陷,从而易于各种曲霉定植于呼吸道,增加机会感染的危险。在925例肺病患者中,研究其BALF中曲霉检出情况与患者的年龄、性别、病程、肺部基础疾病、肺部影像学表现、白细胞计数、合并糖尿病等内分泌系统疾病、合并心血管疾病、合并呼吸系统慢性疾病、合并血液系统疾病、使用抗生素、免疫抑制剂、化疗药等药物治疗>2周等因素的相关性,使用逻辑回归分析后的结果表明:在所有被观察的指标中,“使用抗生素、免疫抑制剂、化疗药等药物治疗>2周”和“合并血液系统疾病”2个因素的优势比(Exp(B))分别为11.906、14.860(P<0.01),“合并糖尿病等内分泌系统疾病”因素的Exp(B)为4.093(P<0.05),提示“使用抗生素、免疫抑制剂、化疗药等药物治疗>2周”,“合并血液系统疾病”和“合并糖尿病等内分泌系统疾病”等3个因素对肺病患者BALF中曲霉的检出率具有显著影响。本研究选择随机引物R108对分离自同一患者呼吸道不同部位的同种曲霉进行RAPD基因分型分析,结果显示:在烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的RAPD带形图中,扩增条带数在1～11条之间,最小片断约为150bp,最大片断大于2kb,不同菌株之间扩增条带的数量和扩增片断的大小均存在差异,即使带型完全一致的菌株,有些片断也存在亮度的差异。对分离自同一患者呼吸道不同部位的同种曲霉种内相似性比较的结果显示:虽然来自同一患者呼吸道不同部位的同种曲霉的形态学特征相同,但是基因型特征却存在差异,说明通过呼吸作用进入肺组织内部的曲霉与患者鼻腔定植的同种曲霉存在差异,提示肺部曲霉的感染可能来源于患者周围的环境中,有效的控制环境中曲霉的污染程度是预防肺部曲霉感染的最有利的手段。在收集标本的过程中,由患者咽拭子的真菌学培养发现了1株马尔尼菲青霉(PM),根据临床表现、实验室检查、组织病理变化、真菌培养结果及菌种分子鉴定,该患者确诊为“非HIV感染的播散性马尔尼菲青霉病”。给予两性霉素B以及伊曲康唑联合抗真菌治疗效果显著。查阅国内外相关文献,尚无由咽拭子真菌培养发现“播散性马尔尼菲青霉病”的相关病例报道。由本例马尔尼菲青霉病(PsM)的发现过程可以推测,PM的真菌孢子由环境进入人体,经过口咽部进入肺组织,随后播散至全身各个组织和器官。也进一步证实了PM感染也可见于正常人群,可能与患者的职业及所处PM流行地区有关。同时提示我们在临床工作中,对于某些原因不明发热、伴广泛肺部炎性浸润和全身淋巴结肿大的患者,在使用广谱抗生素或者正规抗结核治疗无效时,应注意进行真菌学的相关检查。从而达到对PsM的早期诊断及早期治疗,减低病死率,改善患者的生活质量。

全文目录

英文缩写词表  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
论文正文肺病患者呼吸道真菌的检测及分子鉴定  13-61
  前言  13-14
  材料与方法  14-24
  结果  24-39
  讨论  39-43
  附：由咽拭子发现一例非HIV 感染的播散性马尔尼菲青霉病的临床研究  43-54
    前言  43
    临床资料  43-44
    材料与方法  44-49
    结果  49-52
    讨论  52-54
  全文结论  54-56
  致谢  56-57
  参考文献  57-61
文献综述曲霉病的分子流行病学研究进展  61-70
就读硕士期间已经发表和完成的文章  70

肺病患者呼吸道真菌的检测及分子鉴定

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