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产碱性脂肪酶菌株Aspergillus Awamori HB-03的筛选与鉴定及脂肪酶酶学性质的研究

作　者: 黄斌
导　师: 夏金兰
学　校: 中南大学
专　业: 微生物学
关键词: 泡盛曲霉 碱性脂肪酶 分离纯化 酶学性质
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


脂肪酶是一类能催化水解长链三酰甘油脂的酶,是目前最重要的工业酶之一。随着酶生物技术的迅速发展,微生物脂肪酶已成为全世界热门研究的课题。目前,微生物脂肪酶的应用范围已经由最初的食品加工、洗涤、制革行业扩展到化妆品、生物柴油、医药、环境等众多工业和科研领域上。本文从富含油脂的样品中筛选到一株产脂肪酶的真菌HB-03,并对其进行了形态学和分子生物学鉴定；对该菌株的产酶条件进行了优化；对脂肪酶进行了分离纯化,同时对其酶学性质做了初步的研究。(1)来源于长沙各地富含油脂的样品经富集培养后,采用平板水解圈法进行初筛,得到18株可在以橄榄油为唯一碳源的油脂同化培养基上生长且形成明显水解圈的菌株,对这些株菌进行复筛,获得一株产酶活力相对较高的菌株HB-03。(2)利用形态学和分子生物学手段对该菌株进行了鉴定,通过对其菌落特征、个体形态的观察和18S rDNA序列分析,最终确定该菌株为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。(3)通过对HB-03菌株的培养条件及初始产酶培养进行优化,发现了HB-03菌株的在以1%的橄榄油为诱导物,0.5%的蔗糖为碳源,2%的蛋白胨和0.5%的酵母粉为复合有机氮源,0.1%(NH4)2SO4为无机氮源,pH为7.0的培养基中,于30℃,180 rpm的摇床培养36 h,可达最大酶产量—(45.9±2.3)U/mL。(4) Aspergillus awamori HB-03胞外脂肪酶经90%硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤纯化,纯化倍数和回收率分别为10.6和18.84%,经p-NPP比色法测得该酶的比活为1862.2 U/mg。SDS-PAGE显示该脂肪酶分子量约为68 kDa。(5)对纯化的脂肪酶进行酶学性质研究发现,纯化酶的最适作用pH和最适作用温度分别为8.5和40℃,该酶具有一定的热稳定性,在pH 7.0-9.0范围内稳定性也较好；Cu2+,Fe3+和Mg2+在浓度为1mmol/L时就可以抑制酶的活性,其中Cu2+对脂肪酶活性的抑制作用最大；CTAB和SDS强烈抑制纯化酶的活性,而EDTA对其影响非常微弱；纯化脂肪酶对底物p-NPP酶动力学常数Km值和Vmax分别是0.13 mmol/L和60.6 mmol/L/min。综上所述,分离自长沙各地富含油脂的样品的Aspergillusawamori HB-03是一株碱性脂肪酶的高产菌株；对分离纯化自该菌株的碱性脂肪酶的酶学性质研究表明,该酶具有很好的应用前景。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
第一章 绪论  11-23
  1.1 脂肪酶概述  11
  1.2 微生物脂肪酶  11-14
    1.2.1 细菌脂肪酶  11-12
    1.2.2 酵母脂肪酶  12-13
    1.2.3 真菌脂肪酶  13-14
  1.3 产脂肪酶菌株的筛选  14-15
  1.4 脂肪酶的分离纯化  15-17
  1.5 微生物脂肪酶在工业上的应用  17-22
    1.5.1 食品加工业  17-18
    1.5.2 洗涤工业  18-19
    1.5.3 纺织工业  19
    1.5.4 造纸工业  19-20
    1.5.5 制革工业  20
    1.5.6 医药工业  20-21
    1.5.7 化妆品工业  21
    1.5.8 生物柴油生产  21-22
    1.5.9 其他应用  22
  1.6 本课题的研究目的及意义  22-23
第二章 产脂肪酶菌株的筛选  23-30
  2.1 前言  23
  2.2 实验材料和方法  23-27
    2.2.1 实验试剂  23-24
    2.2.2 主要仪器设备  24
    2.2.3 溶液配制  24-25
    2.2.4 培养基  25
    2.2.5 培养方法  25-26
    2.2.6 脂肪酶活力测定方法  26-27
  2.4 结果与讨论  27-28
    2.4.1 产脂肪酶菌株初筛结果  27-28
    2.4.2 复筛结果  28
  2.5 本章小结  28-30
第三章 脂肪酶产生菌的鉴定  30-37
  3.1 前言  30
  3.2 材料与方法  30-34
    3.2.1 实验主要试剂  30-31
    3.2.2 主要仪器和设备  31
    3.2.3 实验菌种  31
    3.2.4 培养基  31
    3.2.5 提取基因组DNA试剂  31
    3.2.6 PCR扩增引物与凝胶回收试剂  31-32
    3.2.7 实验方法  32-34
  3.3 实验结果与分析  34-36
    3.3.1 菌种的表型鉴定结果  34-35
    3.3.2 菌种的18 S rDNA系统发育分析  35-36
  3.4 本章小结  36-37
第四章 产脂肪酶菌株产酶条件优化  37-44
  4.1 前言  37
  4.2 材料与方法  37-39
    4.2.1 主要实验试剂  37
    4.2.2 主要仪器设备  37
    4.2.3 实验菌种  37
    4.2.4 培养基  37
    4.2.5 粗酶制备  37-38
    4.2.6 生物量测定  38
    4.2.7 脂肪酶酶活力的测定  38
    4.2.8 培养条件及培养基组成对Aspergillus awamori HB-03菌株产酶的影  38
    响  38-39
  4.3 实验结果与讨论  39-43
    4.3.1 pH值对产酶的影响  39
    4.3.2 温度对产酶的影响  39-40
    4.3.3 不同诱导物对产酶的影响  40-41
    4.3.4 不同碳源对产酶的影响  41
    4.3.5 不同氮源对产酶的影响  41-42
    4.3.6 HB-03菌株的生长曲线与产酶曲线  42-43
  4.4 本章小结  43-44
第五章 脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究  44-57
  5.1 前言  44-45
  5.2 材料与方法  45-51
    5.2.1 主要试剂  45-46
    5.2.2 主要仪器设备  46
    5.2.3 菌种来源  46
    5.2.4 蛋白纯化试剂配置  46-47
    5.2.5 实验方法  47-51
  5.3 实验结果与讨论  51-56
    5.3.1 HB-03菌株脂肪酶的纯化  51-52
    5.3.2 SDS—PAGE电泳  52-53
    5.3.3 纯化脂肪酶的最适作用pH及pH稳定性  53
    5.3.4 纯化脂肪酶最适作用温度及其热稳定性  53-54
    5.3.5 金属离子对纯化酶活性的影响  54-55
    5.3.6 表面活性剂对脂肪酶活性的影响  55
    5.3.7 脂肪酶动力学常数  55-56
  5.4 本章小结  56-57
第六章 全文总结  57-58
参考文献  58-65
致谢  65-66
研究成果  66

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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