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A型流感病毒冷适应减毒株拯救体系的建立

作　者: 颜艳
导　师: 何维明；王希良
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: A型流感病毒 反向遗传学 8质粒拯救系统 冷适应减毒株 重组病毒
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


流感(Influenza)是由流行性感冒病毒(Influenza virus)感染引起的急性呼吸道传染病。流感病毒属于正粘病毒科,可感染人和多种动物。其中A型流感病毒对人类威胁最大,曾引起人类历史上4次流感大流行。A型流感病毒抗原性易发生变异,抗原的漂移和转换给流感的防治带来了较大困难。接种疫苗仍然是预防和控制流感的主要手段。目前使用的疫苗包括全病毒疫苗、裂解疫苗和减毒活疫苗。减毒活疫苗可通过鼻腔接种诱导局部的黏膜免疫应答和系统免疫应答,是流感疫苗发展的新方向。反向遗传学的快速发展,为开发流感病毒疫苗提供了新手段,1999年以后Neumann等、Hoffmann等分别建立了完全以质粒为基础的流感病毒反向遗传操作系统,在开发新型流感疫苗、快速制备疫苗候选株等方面显示了良好应用前景。本研究选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)(MDV-A)流感病毒株作为骨架病毒,运用8质粒系统拯救出冷适应减毒的A型人流感病毒,建立A型流感病毒冷适应拯救体系,并运用于06～07 A型流感病毒推荐疫苗组分株的拯救,为流感病毒新型疫苗的开发奠定了基础。1.MDV-A 6个内部骨架基因双向转录/表达重组质粒的构建与验证设计一对引物,以pcDNA3.1(+)质粒为模板扩增多聚A(polyA)信号序列,取代双向转录/表达载体pHW2000上牛生长激素(BGH)的多聚腺苷酸信号序列,构建双向转录/表达载体pAD3000。人工合成的MDV-A株6个内部基因片段,克隆至双向转录/表达载体pAD3000,构建6个polⅠ-polⅡ系统的转录/表达质粒,经测序验证6个内部基因片段均在设计位点引入突变,期望6个质粒通过同一个载体,转染后利用细胞中的polⅠ和polⅡRNA聚合酶,实现MDV-A 6个内部基因vRNA和mRNA的转录和表达。用MDV-A任意一个内部基因重组质粒与A/PR/8/34的基因组合,即7+1组合形式共转染COS-1细胞,37℃或33℃、5%CO2培养48h后将转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96h后检测鸡胚尿囊液血凝效价。实验结果表明,6种组合均能产生有血凝性的流感病毒,说明双向转录/表达载体pAD3000能正常工作,含有MDV-A 6个内部基因片段的质粒,在同一载体上实现了vRNA和mRNA的转录和表达,并能装配成病毒,为下一步拯救MDV-A冷适应骨架病毒毒株打下了基础。2冷适应减毒重配A型流感病毒rMDV-A的拯救及部分生物学特性的鉴定用MDV-A 6个内部基因质粒与A/PR/8/34的表面HA和NA基因质粒组合,共转染COS-1细胞,33℃、5%CO2培养48 h,转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96h后检测鸡胚尿囊液血凝效价,得到有血凝性的重组A型流感病毒rMDV-A,电镜形态观察rMDV-A,与野生型流感病毒相似。rMDV-A在鸡胚中传至4代后,收集尿囊液,RT-PCR扩增6个内部基因片段,测序,序列分析与MDV-A 6个内部基因片段序列一致,说明rMDV-A能在鸡胚中稳定增殖。rMDV-A在不加胰酶的情况下感染MDCK细胞,能引起细胞变圆、脱落等病变。收集PR8和rMDV-A病毒在33℃、37℃、38℃和39℃四个温度培养的鸡胚尿囊液,测定两种病毒在MDCK细胞上空斑形成单位(PFU),结果表明rMDV-A效价随着温度的升高有明显下降趋势。到39℃时,病毒效价急剧下降,可见rMDV-A对温度敏感,较低温度(如33℃)更适于rMDV-A病毒的繁殖。rMDV-A的拯救和鉴定,说明成功建立了A型流感病毒冷适应减毒株拯救体系,为开发A型流感病毒减毒疫苗奠定了基础。3.06～07 A型流感病毒冷适应候选疫苗株的拯救RT-PCR扩增06～07 A型流感病毒推荐疫苗组分株A/New Caledonia/20/99(H1N1)和A/Wisconsin/67/2005(H3N2)的HA和NA基因,连接pGEM-T载体并测序,得到序列正确的HA和NA基因,并克隆至双向转录/表达载体pAD3000上,分别与MDV-A 6个内部基因共转染COS-1细胞,33℃、5%CO2培养48 h,转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96h后检测鸡胚尿囊液血凝效价,得到有血凝性的重组A型流感病毒rMDV-A-H1,rMDV-A-H3,拯救出06～07 A型流感病毒冷适应候选疫苗株,为06～07流感病毒减毒三价疫苗的开发与生产奠定基础。本研究运用8质粒拯救系统建立了A型流感病毒冷适应拯救体系,为流感病毒新型疫苗的开发提供了新的手段。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-14
文献综述  14-30
  第一章 A 型流感病毒的反向遗传操作技术及运用  14-30
    1.1 A 型流感病毒及其基因组特征  14-15
    1.2 流感病毒的复制  15-18
      1.2.1 吸附、穿膜和脱壳  16
      1.2.2 基因组的转录与复制  16
      1.2.3 病毒蛋白的合成  16-17
      1.2.4 病毒粒子的装配  17
      1.2.5 病毒的出芽和释放  17-18
    1.3 流感病毒反向遗传操作技术体系的建立  18-24
      1.3.1 流感病毒功能性RNPS 的建立  18-19
      1.3.2 以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统  19-21
      1.3.3 完全以克隆的 cDNA 为基础的反向遗传操作系统  21-24
    1.4 流感病毒反向遗传操作技术的应用  24-28
      1.4.1 研究流感病毒基因产物及其对病毒的生活周期与致病性的作用  25-27
      1.4.2 用流感病毒作为载体系统表达外源基因  27-28
      1.4.3 研制经基因修饰的疫苗候选株  28
    1.5 结束语  28-30
研究内容  30-58
  第二章 MDV-A 6 个内部骨架基因双向转录/表达重组质粒的构建与验证  30-42
    2.1 材料  31-32
      2.1.1 病毒、鸡胚、细胞和菌种  31
      2.1.2 8 质粒病毒拯救系统  31-32
      2.1.3 主要试剂  32
      2.1.4 主要仪器  32
      2.1.5 分子生物学分析软件  32
      2.1.6 常用溶液的配置  32
    2.2 方法  32-39
      2.2.1 引物的设计与合成  32-33
      2.2.2 双向转录表达载体PAD3000 的构建策略及构建  33
      2.2.3 转录表达载体的工作原理  33-35
      2.2.4 转录/表达载体构建:克隆流感病毒各片段CDNA 到PAD3000 的策略  35
      2.2.5 建立流感病毒反向遗传操作技术的路线  35
      2.2.6 双向转录表达载体PAD3000 的构建  35-37
      2.2.7 MDV-A 6 个内部基因片段重组质粒的构建  37-38
      2.2.8 6 个内部质粒序列分析  38
      2.2.9 质粒的重组  38
      2.2.10 共转染  38-39
    2.3 结果  39-40
      2.3.1 双向转录表达载体PAD3000 的构建  39
      2.3.2 MDV-A 6 个内部基因片段重组质粒的构建及基因分析  39
      2.3.3 7+1 病毒拯救  39-40
    2.4 讨论  40-41
    2.5 结论  41-42
  第三章 冷适应减毒的重配A 型流感病毒RMDV-A 的拯救及部分生物学特性的鉴定  42-50
    3.1 材料  43
      3.1.1 细胞、鸡胚和血清  43
      3.1.2 8 质粒病毒拯救系统  43
      3.1.3 主要试剂  43
    3.2 方法  43-44
      3.2.1 引物合成与设计  43
      3.2.1 质粒的提取  43
      3.2.2 MDV-A 冷适应株的拯救  43-44
      3.2.3 重配病毒RMDV-A 部分生物学特性的鉴定  44
    3.3 结果  44-47
      3.3.1 MDV-A 冷适应株的拯救  44-45
      3.3.2 RT-PCR 鉴定  45
      3.3.3 电镜观察  45-46
      3.3.4 RMDV-A 重配病毒感染MDCK 细胞  46
      3.3.5 重配病毒冷适应表型鉴定  46-47
    3.4 讨论  47-49
      3.4.1 用8 质粒系统产生冷适应重配流感病毒RMDV-A  47-48
      3.4.2 提高拯救效率应注意的问题  48-49
    3.5 结论  49-50
  第四章 06～07 A 型流感病毒冷适应疫苗株的拯救  50-58
    4.1 材料  51
      4.1.1 病毒、鸡胚、细胞和菌种  51
      4.1.2 8 质粒病毒拯救系统  51
      4.1.3 主要试剂  51
      4.1.4 主要仪器  51
      4.1.5 分子生物学分析软件  51
    4.2 方法  51-55
      4.2.1 用于RNA 操作试剂和器材的DEPC 处理  51-52
      4.2.2 引物的设计与合成  52
      4.2.3 病毒基因组RNA 的提取  52
      4.2.4 反转录（RT）病毒全基因组  52
      4.2.5 聚合酶链反应（PCR）扩增病毒HA 和NA 基因  52-53
      4.2.6 目的片段的回收  53
      4.2.7 目的片段与T 载体的连接  53
      4.2.8 连接产物的转化  53
      4.2.9 重组质粒的鉴定  53
      4.2.10 重组双向转录/表达质粒的构建  53-54
      4.2.11 单一基因片段的功能验证  54
      4.2.12 06～07 流感病毒冷适应株的拯救  54
      4.2.13 重配病毒RMDV-A-H1、RMDV-A-H3 的初步鉴定  54-55
    4.3 结果  55-57
      4.3.1 HA﹑NA 基因RT-PCR  55
      4.3.2 重组质粒酶切鉴定  55
      4.3.3 7+1 病毒拯救  55-56
      4.3.4 RMDV-A-H1、RMDV-A-H3 冷适应株的拯救  56-57
      4.3.5 RMDV-A-H1、RMDV-A-H3 RT- PCR 测序鉴定  57
    4.4 讨论  57
    4.5 结论  57-58
结论  58-60
参考文献  60-68
附录（缩略语）  68-70
致谢  70-72
个人简介  72

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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