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应用SPR生物传感器快速检测A型流感病毒研究

作　者: 王海静
导　师: 何宏轩；赵宝华
学　校: 河北师范大学
专　业: 微生物学
关键词: SPR生物传感器 A型流感病毒快速检测
分类号: Q939.4-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

H5N1亚型高致病性禽流感严重威胁着人类及动物的健康。1997年香港H5N1禽流感病毒传播到人事件的发生,更突出显示了禽流感防治的公共卫生意义。现有的禽流感诊断方法主要包括病毒分离法、RT-PCR、NASBA、胶体金免疫层析技术等。每种诊断方法各有其优点,但又受到几个不利因素的限制,如成本高、处理周期长以及灵敏度低等,尤其在定量分析禽流感病毒含量及病毒亚型判定的即时、准确性方面尚需改进。本研究应用SPR生物传感器实时监测传感器芯片表面发生的抗原抗体结合/解离反应,具有快速、简便、敏感、特异、成本低等特点,可作为现有禽流感诊断方法的有益补充,用于检测采集样品或鸡胚尿囊液、细胞培养物中的禽流感病毒。本研究制备了一种检测H5亚型流感病毒抗原的抗体芯片和一种检测A型流感病毒抗原的抗体芯片,利用单通道单参数表面等离子体谐振生物传感器对H5亚型禽流感病毒和A型流感病毒的快速检测方法进行了研究,两者都可以直接用于样品的检测。在快速检测H5亚型流感病毒研究中,分析比较了四种不同的检测方法的检测效果,以期获得最灵敏、快速的检测方法,这四种方法分别为蛋白A固定抗体检测法、竞争抑制法、抗体夹心检测法和直接检测法。对试验结果分析比较发现:将病毒样品用1% Triton X-100在室温条件下裂解90 min后,采用直接检测法较其它几种方法更为快速。直接检测法原理如下:抗H5N1亚型流感病毒血凝素(HA)单克隆抗体固定在传感器芯片表面以捕获样品中病毒抗原片段,通过监测反应过程中芯片表面折射率的变化获得相关抗原片段结合量数据,对数据进行分析后判定样品中检测物存在与否及含量。通过直接检测法确立的H5亚型流感病毒的检测范围为5ng/mL-500ng/mL。对抗体芯片的特异性、稳定性进行了研究,该抗体芯片对两株H5N1亚型禽流感病毒具有特异的检测效果,对杂蛋白无结合作用,与同为A型流感病毒的H9N2亚型无结合反应。在H5亚型流感病毒快速检测方法建立基础之上,本研究制备了检测A型流感病毒的抗体芯片,并对A型流感病毒的快速检测方法进行了初步的探索,证实A型流感病毒检测芯片对A型流感病毒的高致病型H5亚型和我国高发型H9亚型均具有较高的特异性。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
引言  9-11
1 文献综述  11-32
  1.1 流感病毒概况  11-19
    1.1.1 流感病毒的流行  11-15
    1.1.2 流感病毒检测技术及方法研究进展  15-19
  1.2 SPR 生物传感器原理及研究现状  19-26
    1.2.1 SPR 生物传感器原理  19-21
    1.2.2 SPR 生物传感器的优点  21-22
    1.2.3 SPR 生物传感器应用领域  22-23
    1.2.4 SPR 生物传感器在病毒研究领域的应用  23-26
  1.3 本研究目的和意义  26-28
  本章参考文献  28-32
2 应用SPR 生物传感器快速检测H5 亚型流感病毒  32-55
  2.1 材料和方法  32-43
    2.1.1 检测生物芯片的制备  32-37
    2.1.2 不同样品裂解方法对检测结果的影响  37-40
    2.1.3 抗原抗体反应条件的优化  40
    2.1.4 抗体稳定性及特异性实验  40-42
    2.1.5 芯片稳定性测试  42
    2.1.6 应用SPR 生物传感器检测H5 亚型流感病毒  42-43
  2.2 结果与分析  43-54
    2.2.1 检测生物芯片的制备  43-45
    2.2.2 不同裂解方法对检测结果的影响  45-48
    2.2.3 抗原抗体反应的优化条件  48-49
    2.2.4 抗体稳定性和特异性实验  49-51
    2.2.5 芯片稳定性和保存方式  51
    2.2.6 SPR 生物传感器检测H5 亚型流感病毒  51-54
  2.3 小结  54-55
3 不同检测方法检测效果的比较  55-65
  3.1 材料和方法  55-60
    3.1.1 直接检测病毒粒子  55-56
    3.1.2 蛋白A 定向固定抗体检测法  56-57
    3.1.3 竞争抑制法  57-58
    3.1.4 抗体夹心法  58-59
    3.1.5 直接检测法  59
    3.1.6 SPR 检测方法与ELISA 检测方法比较  59-60
  3.2 结果与分析  60-64
    3.2.1 蛋白A 定向固定抗体检测法  60-61
    3.2.2 竞争抑制法  61
    3.2.3 抗体夹心法  61-62
    3.2.4 直接检测法  62-63
    3.2.5 SPR 检测方法与ELISA 检测试剂盒方法比较  63-64
  3.3 小结  64-65
4 应用SPR 生物传感器检测A 型流感病毒初步研究  65-71
  4.1 试验材料和方法  65-68
    4.1.1 抗体特异性和稳定性测试  65-67
    4.1.2 A 型流感病毒检测生物芯片的制备  67-68
    4.1.3 应用SPR 生物传感器检测H5 亚型和H9 亚型流感病毒  68
  4.2 结果与分析  68-70
    4.2.1 抗体固定条件的确定  68-69
    4.2.2 抗H5N1 M1 单克隆抗体的特异性检测效果  69-70
    4.2.3 应用SPR 生物传感器检测H5 和H9 亚型流感病毒  70
  4.3 小结  70-71
讨论  71-74
结论  74-77
参考文献  77-79
附录  79-83
  缓冲液配方  79-82
  缩略词表  82-83
后记（含致谢）  83-84
攻读学位期间取得的科研成果清单  84

应用SPR生物传感器快速检测A型流感病毒研究

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