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人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白的原核表达及纯化

作　者: 麻粉莲
导　师: 李引乾；侯云德
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 人甲型流感病毒 H1N1亚型 NS1蛋白 原核表达 纯化
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 51次
引　用: 1次
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内容摘要


目的表达并纯化人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白,为后期的拮抗NS1蛋白的短肽筛选工作奠定基础。方法(1)用RT-PCR法从人甲型流感病毒株A/PR/8/34/(H1N1)中扩增NS1基因,克隆入原核表达载体pTXB1,构建重组原核表达质粒pTXB1/NS1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析NS1蛋白表达形式和表达量。(2)将1.0 mmol/L IPTG加入到重组表达载体pTXB1/NS1中,分别在26℃、28℃、30℃、32℃、35℃和37℃诱导表达4 h;在最佳诱导温度下,分别诱导4 h、8 h和12 h,寻求最佳的表达时间。(3)用几丁质柱亲和层析纯化表达蛋白,12% SDS-PAGE电泳对纯化的NS1蛋白进行鉴定,最后用串联飞行时间质谱仪检测NS1蛋白相对分子质量。结果所构建的重组表达质粒pTXB1/NS1序列完整,插入的基因片段全长690 bp。以1.0 mmol/L IPTG、37℃诱导4 h,重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的50%以上,破菌上清及沉淀中均有目的蛋白表达。纯化的NS1蛋白纯度达95 %以上,相对分子质量为26 340,与预期大小相符。结论(1)本试验成功表达A/PR/8/34/(H1N1) NS1蛋白。(2)经几丁质柱亲和层析纯化得到NS1蛋白。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第一章 文献综述  8-17
  1.1 流感病毒的分子结构  8-9
  1.2 流感病毒的复制过程  9-10
  1.3 流感的流行状况  10-12
    1.3.1 甲、乙、丙型流感的流行情况  10
    1.3.2 流感病毒抗原性的变异  10
    1.3.3 20 世纪四次流感大流行  10-12
  1.4 流感病毒的理化特性  12
    1.4.1 对热的稳定性  12
    1.4.2 对pH 的稳定性  12
    1.4.3 对紫外线的稳定性  12
    1.4.4 对化学物的稳定性  12
  1.5 甲型流感病毒NS1 蛋白结构及功能  12-14
    1.5.1 NS1 蛋白抑制宿主细胞蛋白合成  12-13
    1.5.2 NS1 蛋白应用于动物鉴别诊断  13
    1.5.3 NS1 蛋白拮抗干扰素的作用  13
    1.5.4 NS1 蛋白下调细胞凋亡  13-14
  1.6 抗流感药物的研究进展  14-17
    1.6.1 流感疫苗的研究概况  14-15
    1.6.2 抗流感化学药物研究概况  15-17
第二章 人甲型流感病毒H1N1 亚型NS1 蛋白的原核表达  17-34
  2.1 材料和方法  17-26
    2.1.1 试验材料  17-19
    2.1.2 试验方法  19-26
  2.2 结果  26-30
    2.2.1 流感病毒A/PR/8/34（H1N1）总RNA 的鉴定  26-27
    2.2.2 流感病毒A/PR/8/34（H1N1）NS1 基因的PCR 扩增产物鉴定  27
    2.2.3 重组克隆质粒的鉴定  27-28
    2.2.4 重组表达质粒的鉴定  28
    2.2.5 表达产物的分析  28-30
  2.3 讨论  30-32
    2.3.1 A/PR/8/34(H1N1) NS1 基因的生物学特性  30
    2.3.2 A/PR/8/34(H1N1) NS1 蛋白诱导表达  30-31
    2.3.3 表达载体pTXB1的选择  31
    2.3.4 A/PR/8/34(H1N1) NS1 基因的克隆  31-32
  2.4 小结  32-34
第三章 pTXB1/NS1 融合蛋白的纯化  34-41
  3.1 材料与方法  34-36
    3.1.1 试验材料  34-35
    3.1.2 试验方法  35-36
  3.2 结果  36-37
    3.2.1 表达产物的纯化  36
    3.2.2 NS1 蛋白相对分子量的检测  36-37
  3.3 讨论  37-40
  3.4 小结  40-41
结论  41-42
参考文献  42-47
附录一  47-48
致谢  48-49
作者简介  49

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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