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活性分子在甲醇毕赤酵母pichia pastoris中的表达及特异性DNA蛋白结合因子的纯化及鉴定

作　者: 潘登
导　师: 徐洵
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 毕赤酵母表达系统肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体人工合成抗菌CEME基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

甲醇毕赤酵母Pichia pastoris表达系统是继酿酒酵母之后的第二代酵母表达系统。它不仅具有原核表达系统生长快速，操作简单，外源基因表达量大并受到严格调控等特点，还具有真核生物特有的蛋白质翻译后修饰的功能，表达真核生物蛋白质具有原核表达系统无法比拟的优越性。因此它在基因工程方面的应用越来越受到人们的重视，已被广泛应用于一系列胞内及胞外蛋白的高水平表达。我们利用这个系统分别对人的TRAIL(TNF Related Apoptosis Induced Ligand,TRAIL／Acl2)基因可溶性部分和抗菌肽CEME基因的表达进行了研究。人的TRAIL基因是新发现的肿瘤坏死因子TNF超家族的成员，它具有专一的诱导癌细胞调亡的作用，而对正常细胞没有任何杀伤作用，是一种很有潜力的抗癌药物。我们根据酵母偏爱密码子原则，设计了TRAIL基因可溶性的功能区片段，克隆至酵母分泌型的整合载体pPIC9K中。通过电转化作用该基因片段被成功地整合至酵母Cs115的染色体上，经过甲醇诱导之后，该基因得到了分泌表达。我们筛选到一株高表达的菌株GTr48，经过甲醇诱导之后TRAIL基因表达量占总的酵母分泌蛋白的38％以上，并且初步估计其表达量可以达到每升十几毫克以上。通过与Gs115空白酵母诱导产物的对照，我们确定TRAIL基因的表达产物具有抑制癌细胞生长的活性。抗菌肽是一种在动植物体内发现的一种具有广谱性抗菌作用的小分子多肽，它们在体内的免疫防卫系统中起到重要的作用。它们具有特殊的分子结构，能够识别细菌的细胞膜并与之结合，能够在细胞膜上产生孔洞，而造成内容物的外泄作用，导致细菌的死亡。由于它能够代替抗生素抑制细菌的作用，防止细菌抗药性的产生，因此是目前抗菌类药物的研究热点。由于抗菌肽特殊的功能特点，所以至今还没有能够在原核系统胞内直接成功表达的范例。我们根据人工设计的新型抗菌肽CEME序列设计CEME基因，重组到酵母胞内表达型的整合载体pHILD2中，通过电转化作用将CEME基因整合至酵母宿主Gsll5染色体上。通过优化转化酵母的诱导条件，筛选到三株阳性转化酵母，它们的诱导产物裂解物中具有了抑制和枯草杆菌的生长的活性物资。该酵母有希望成为一种新型的饲料添加剂在鱼类疾病的防治中得到应用。

全文目录

1．前言  6-18
  1．1 Pichia pastoris表达系统  6-11
  1．2 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL  11-14
  1．3 抗菌肽的研究进展  14-18
2．材料及方法  18-29
  2．1 材料  18
  2．2 引物  18
  2．3 其它酶类及试剂  18-19
    2．3．1 酶类  18
    2．3．2 其它试剂  18-19
  2．4 常用溶液、培养基的配制  19-22
  2．5 主要仪器  22-23
  2．6 基本方法  23-25
  2．7 含TRAIL片段的分泌型重组酵母的构建  25-27
  2．8 含抗菌肽CEME胞内型表达酵母的构建  27-29
3．结果及分析  29-38
  3．1 TRAIL基因可溶性部分在甲醇酵母中的表达  29-34
  3．2 CEME在甲醇酵母中的表达  34-38
4．讨论  38-41
5．参考文献  41-94

活性分子在甲醇毕赤酵母pichia pastoris中的表达及特异性DNA蛋白结合因子的纯化及鉴定

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