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新型免疫毒素mST的表达、纯化及细胞毒性分析

作　者: 蔡华伟
导　师: 卢晓风
学　校: 四川大学
专　业: 遗传学
关键词: 免疫毒素免疫抑制剂单链抗体 CTLA4 大肠杆菌表达系统毕赤酵母表达系统细胞毒性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

免疫毒素因具有细胞选择性杀伤活性而在一些疾病治疗中显示出广阔的应用前景。免疫毒素通常由识别片段和杀伤片段组成，识别片段决定分子对细胞的选择识别特性，杀伤片段决定分子的杀伤效率和作用方式。活化T细胞是介导移植排斥的重要细胞，选择性清除活化T细胞可能减轻移植排斥反应。活化T细胞表面诱导性表达T淋巴细胞相关毒性抗原4（CTLA-4）分子，因此，利用针对CTLA4的单链抗体为识别片段，融合能够作用于细胞膜的通道形成杀伤片段，构建的免疫毒素可能选择性清除活化T细胞，具有被开发为新的免疫抑制剂的潜力。根据这一设想，本研究分别选择了抗小鼠CTLA-4单链抗体mS和能在真菌细胞膜上打孔的抗真菌肽T为识别片段和杀伤片段，设计了表观分子量大约为34kD的新型免疫毒素mST；通过基因工程手段，先后在原核大肠杆菌和真核毕赤酵母系统中进行表达；进而分离纯化重组蛋白，并对其细胞杀伤活性进行了初步分析。结果发现：1)将mST基因插入原核大肠杆菌表达系统pQE30载体中，28℃条件下，经0.1 mmol／L IPTG诱导，表达菌超声破碎后，其上清经Ni-NTA亲和层析，可以获得少量的可溶性mST蛋白；多数mST蛋白以不可溶的包涵体形式表达，包涵体沉淀用6M盐酸胍进行溶解，然后在8M尿素存在的情况下经Ni-NTA分离纯化，可获得大量mST包涵体蛋白；在4℃，50 mM Tris-HCl，1 M Urea，0.8 M L-Arginine，2 mM GSH，0.2mM GSSH，pH8.0条件下透析复性48h，约70％包涵体蛋白可以被复性，但是，在去除复性液中残留变性剂的过程中，蛋白损失较大，最终蛋白浓度大约只有0.1mg／ml左右。2)由于包涵体蛋白复性困难，重复性差，因此本论文进一步选择能够分泌表达重组蛋白的真核毕赤酵母体系对mST进行表达。将mST基因插入pPIC9K后再通过电穿孔转入毕赤酵母GS115，长出的单克隆经3轮培养后进行Geneticin^?-YPD平板筛选，从1mg／ml的Geneticin^?-YPD板上获得了多拷贝重组子；在28℃，280rpm的条件下培养至OD600=2～6，浓缩10倍后，利用3％甲醇的BMMY诱导96h，从100ml培养上清中可获得0.1mg目的蛋白。3)活性分析发现，从大肠杆菌细胞质内分离纯化的可溶mST在0.5，1和2 uM浓度下，对小鼠淋巴瘤细胞（EL4）的杀伤率分别为36％±11.2％，44％±3.8％，64％±9.1％；从包涵体复性获得的mST在0.5，1和2uM浓度下对EL4的杀伤率分别为24％±13.1％，45％±10.1％，62％±10％；而从毕赤酵母表达体系中获得的mST在1uM浓度下对EL4的杀伤率为37.5％±2.2％。而单链抗体mS在这些浓度下对EL4没有明显杀伤作用。上述结果表明，mST在大肠杆菌中以可溶和包涵体形式表达，但主要为不具活性的包涵体；在毕赤酵母PIC9K体系中以可溶蛋白形式表达，但产量不高，大约每升诱导培养基可获得1mg蛋白；活性分析发现，不同来源的mST对EL4细胞均表现了一定的杀伤，表明该免疫毒素的设计是可行的。在今后的工作中，尚需进一步优化mST的表达条件，获取大量的蛋白，对其体内外细胞杀伤活性及特异性进行研究，确定其抗移植物排斥效果及作为新型免疫抑制剂的可能性。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-16
  参考文献  14-16
实验流程图  16-17
第一部分 mST大肠杆菌原核表达及体外细胞毒性测试  17-37
  1.mST大肠杆菌原核表达质粒构建  17-30
    1.1 材料  17-19
      1.1.1 细菌和载体  17-18
      1.1.2 主要试剂  18
      1.1.3 主要仪器和设备  18-19
    1.2 方法  19-24
      1.2.1 mST原核表达基因的构建  19-21
      1.2.2 mST在大肠杆菌中的诱导表达  21-22
      1.2.3 mST诱导可溶蛋白的分离纯化:  22
      1.2.4 mST包涵体纯化及复性  22-24
    1.3 结果  24-29
      1.3.1 mST原核表达的分子构建  24-25
      1.3.2 mST在大肠杆菌的诱导表达  25-26
      1.3.3 mST蛋白的纯化  26-27
      1.3.4 包涵体纯化及复性  27-28
      1.3.5 mS的分子构建及蛋白表达、纯化和包涵体复性  28-29
    1.4 小结  29-30
  2.mST体外细胞杀伤功能初步测试  30-37
    2.1 材料  30
      2.1.1 主要试剂  30
      2.1.2 主要仪器  30
    2.2 方法  30-32
      2.2.1 细胞选择与培养  30
      2.2.2 蛋白的预处理  30-31
      2.2.3 mST体外细胞毒性实验  31-32
    2.3 结果  32-36
      2.3.1 mST对EL4的杀伤效果  32-34
      2.3.2 细胞杀伤的形态学观察  34-36
    2.4 小结  36-37
第二部分 mST真核毕赤酵母表达及细胞毒性测试  37-62
  3.mST毕赤酵母表达株构建  37-50
    3.1 材料  37-39
      3.1.1 细菌与载体  37-38
      3.1.2 主要试剂  38
      3.1.3 主要仪器和设备  38-39
    3.2 方法  39-44
      3.2.1 表达质粒pPIC9K-mST的构建  39-40
      3.2.2 表达质粒的线性化及质粒浓缩  40-41
      3.2.3 酵母电转化感受态制备  41-42
      3.2.4 毕赤酵母细胞的电穿孔转化  42-43
      3.2.5 多拷贝插入重组子的筛选  43-44
      3.2.6 鉴定Mut+和Muts  44
      3.2.7 菌株保存  44
    3.3 结果  44-49
      3.3.1 表达质粒pPIC9K-mST的构建  44-45
      3.3.2 表达质粒与空载体的线性化  45-46
      3.3.3 毕赤酵母GS115的电穿孔转化  46-47
      3.3.4 GS115多拷贝插入重组子的筛选  47-49
    3.4 小结  49-50
  4.mST在毕赤酵母中的分泌表达与纯化  50-58
    4.1 材料  50-51
      4.1.1 主要材料和试剂  50
      4.1.2 主要仪器和设备  50-51
    4.2 方法  51-53
      4.2.1 PIC9K-mST的诱导  51
      4.2.2 最佳诱导时间与最佳甲醇浓度的确立  51-52
      4.2.3 PIC9K-mST纯化  52-53
    4.3 结果  53-57
      4.3.1 mST蛋白的初次诱导  53-54
      4.3.2 目的蛋白表达的优化  54-56
      4.3.3 PIC9K-mST纯化  56
      4.3.4 PIC9K-mS的制备  56-57
    4.4 小结  57-58
  5.PIC9K-mST体外杀伤功能初步测试  58-62
    5.1 材料  58
      5.1.1 主要试剂  58
      5.1.2 主要仪器  58
    5.2 方法  58-60
      5.2.1 细胞培养  58
      5.2.2 蛋白的预处理  58-60
    5.3 结果  60-61
      5.3.1 PIC9K-mST对EL4的杀伤作用  60-61
    5.4 小结  61-62
讨论  62-68
全文总结  68-70
参考文献  70-74
综述  74-85
  重组免疫毒素构建的研究进展  74-83
  参考文献  83-85
致谢  85-86
个人简介  86

新型免疫毒素mST的表达、纯化及细胞毒性分析

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