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葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及转基因番茄、酵母表达系统的建立

作　者: 郭芝光
导　师: 尉亚辉
学　校: 西北大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 白藜芦醇白藜芦醇合酶转基因番茄毕赤酵母表达系统
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

白藜芦醇(Resveratrol,简称Res)是一种植物抗毒素,具有抗菌、抗氧化、抗血小板凝集、保护心血管、抗癌等多种保健作用。最新研究还表明,Res可使脊椎动物非洲齿鲤的寿命延长60%,并使其神经细胞衰老减慢,这一结果意味着白藜芦醇很可能让包括人类在内的其他脊椎动物的寿命延长。然而,在自然的条件下,Res在植物体内的含量非常低,要用传统的提取方法得到高丰度的Res非常困难,并且成本较高。白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,简称RS)是Res合成途径中最后一个起作用的关键酶,本实验通过分子生物学手段,得到白藜芦醇合酶基因,并分别建立了其植物和毕赤酵母表达系统,以期望得到稳定的、高丰度的白藜芦醇,目前已取得了如下进展: 利用PCR的方法从葡萄基因组中得到RS基因,并构建克隆载体pBS-T/RS,测序结果与NCBI上登陆号S63221的核苷酸序列比对,同源性达到98%;与登陆号为DQ459351.1的核苷酸序列比对,同源性达到99%。与登陆号ABE68894.1的氨基酸序列比对,同源性达到98%,葡萄RS基因全长1179bp,编码392个氨基酸,证明RS基因成功克隆至pBS-T载体中。利用酶切、连接等方法将RS基因插入到植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,成功构建植物表达载体pBI121/RS,冻融法转入农杆菌LBA4404。利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄并初步建立转基因番茄的再生体系,HPLC法测定显示转化番茄中已产生Res。成功构建含有AOX1强效启动子、HIS4筛选基因的酵母表达载体pPIC3.5K/RS。并用电激法将该载体整合进毕赤酵母基因组中,发酵实验及SDS-PAGE分析表明目的蛋白已表达。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
第一部分文献综述  10-24
  1. 白藜芦醇的研究进展  10-12
    1.1 白藜芦醇及其理化性质  10
    1.2 白藜芦醇的药理作用及作用机理  10-11
    1.3 白藜芦醇的生物合成  11-12
  2. 白藜芦醇合酶的研究进展  12-18
    2.1 白藜芦醇合酶及其诱导  12-15
      2.1.1 二苯乙烯合酶  12
      2.1.2 RS的酶学性质  12-13
      2.1.3 RS的诱导  13-15
    2.2 白藜芦醇合酶基因的研究进展  15-18
      2.2.1 白藜芦醇合酶基因的结构  15
      2.2.2 葡萄RS基因  15-16
      2.2.3 白藜芦醇合成酶基因的转基因技术研究进展  16-17
      2.2.4 白藜芦醇合成酶基因在基因转导过程中的异常表达  17-18
      2.2.5 PR 10启动子控制下的RS基因表达及白藜芦醇积累  18
  3. 酵母表达系统的研究进展  18-22
    3.1 酵母表达系统的优点  19-20
    3.2 影响酵母表达系统表达和应用的因素  20-22
      3.2.1 目的基因的特性  20
      3.2.2 启动子选择  20-21
      3.2.3 起始密码子 AUG的旁侧序列  21
      3.2.4 外源基因拷贝数  21
      3.2.5 表达产物的稳定性  21
      3.2.6 培养条件  21-22
  4. 本研究的目的、意义及内容  22-24
第二部分材料和方法  24-41
  1. 主要试剂及仪器  24-28
    1.1 基本试剂及生产厂家  24
    1.2 酶及其它试剂  24
    1.3 质粒和菌株  24
    1.4 主要仪器和厂家  24-25
    1.5 培养基  25-27
      1.5.1 酵母培养基母液  25
      1.5.2 培养基  25-27
      1.5.3 抗生素及激素:  27
    1.6 溶液配方  27-28
      1.6.1 质粒提取溶液  27
      1.6.2 大肠杆菌感受态细胞制备溶液  27
      1.6.3 植物总DNA提取溶液  27
      1.6.4 酵母基因组DNA提取溶液  27-28
  2. 实验材料  28
  3. 实验方法  28-41
    3.1 白藜芦醇合酶基因的克隆  28-32
      3.1.1 CTAB法提取葡萄叶片总DNA  28
      3.1.2 PCR引物的设计  28-29
      3.1.3 白藜芦醇合酶基因的扩增  29-30
      3.1.4 克隆载体pBS-T/RS的构建  30-31
      3.1.5 重组质粒pBS-T/RS的鉴定  31-32
    3.2 植物表达系统的建立及鉴定  32-36
      3.2.1 植物表达载体pBI 121/RS的构建  32-33
      3.2.2 植物表达载体pBI 121/RS的鉴定  33-34
      3.2.3 根癌农杆菌的的转化及鉴定  34
      3.2.4 转基因植物再生体系的建立  34-35
      3.2.5 转基因植株的初步鉴定  35
      3.2.6 HPLC法测定转基因植株中的Res  35-36
    3.3 酵母表达系统的建立和鉴定  36-41
      3.3.1 酵母表达载体pPIC3.5K/RS的构建  36-37
      3.3.2 酵母表达载体pPIC3.5K/RS的鉴定  37
      3.3.3 毕赤酵母GS115的转化  37-38
      3.3.4 酵母重组子的鉴定  38-39
      3.3.5 重组酵母的诱导表达试验  39-40
      3.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)定性分析蛋白质  40-41
第三部分结果与分析  41-53
  1 白藜芦醇合酶基因的克隆  41-46
    1.1 CTAB法提取葡萄叶片总DNA  41
    1.2 目的基因的扩增  41-42
    1.3 重组质粒pBS-T/RS的鉴定  42-46
      1.3.1 重组质粒pBS-T/RS的PCR及双酶切鉴定  42
      1.3.2 重组质粒pBS-T/RS序列测定及分析  42-46
  2. 植物表达系统的建立及鉴定  46-50
    2.1 植物表达载体构建过程  46
    2.2 植物表达载体pBI 121/RS的PCR及双酶切鉴定  46-47
    2.3 农杆菌LBA4404/RS阳性克隆的PCR鉴定  47-48
    2.4 转基因植物再生体系的建立  48
    2.5 转基因植株的初步鉴定  48
    2.6 HPLC法测定转基因植株中的Res  48-50
  3. 酵母表达系统的建立和鉴定  50-53
    3.1 酵母表达载体构建过程  50
    3.2 酵母表达载体pPIC3.5K/RS的PCR及双酶切鉴定  50-51
    3.3 毕赤酵母GS115转化及鉴定  51-52
    3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)定性分析蛋白质  52-53
第四部分讨论  53-57
  1. 转化外植体的成活率  54
  2. 转基因番茄的筛选  54-55
  3. 关于重组毕赤酵母  55-57
    3.1 醇氧化酶强效启动子  55
    3.2 转化子的筛选  55-56
    3.3 表达载体与宿主染色体的整合  56-57
第五部分小结  57-58
第六部分参考文献  58-66
图版  66-67
致谢  67

葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及转基因番茄、酵母表达系统的建立

内容摘要

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