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人Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及表达产物的功能研究

作　者: 张树军
导　师: 杨磊；黄瑾
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Neuritin 毕赤酵母表达系统 PC12细胞鸡胚背根神经节
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的:构建neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,获取具有天然活性的Neuritin蛋白,并对其进行功能研究,为进一步探讨neuritin的功能及作用机制奠定基础。方法:PCR扩增neuritin ORF,将其克隆到穿梭质粒pPIC9K中,转化DH5α菌,经PCR和测序鉴定;抽提测序正确的pPIC9K-neuritin重组穿梭载体,线性化后电激转化GS115毕赤酵母菌,使用G418筛选出稳定表达的酵母重组子,经PCR及酵母基因组测序正确;用甲醇诱导酵母重组子分泌表达Neuritin蛋白,并优化诱导表达的条件;表达产物经SDS-PAGE鉴定后,用镍离子亲和层析法从酵母培养上清中纯化目的蛋白,纯化后的蛋白再经Western-blot鉴定。最后,将纯化的Neuritin蛋白分别加入到PC12细胞和鸡胚背根神经节的培养基中,对其生物学功能进行研究。结果:1.构建了neuritin基因片段的重组穿梭质粒pPIC9K-neuritin,经PCR鉴定和序列分析证实,neuritin基因已正确插入穿梭质粒的多克隆位点。2.获得了neuritin毕赤酵母重组子,经PCR鉴定和序列分析证实,neuritin基因已正确重组入酵母基因组中。3.用甲醇诱导neuritin酵母重组子表达获取了Neuritin重组蛋白,经SDS-PAGE分析,Neuritin重组蛋白以分泌的形式存在于酵母培养上清中,其分子量约为12KDa。最佳诱导表达时间是72h。4.用镍离子亲和层析法从酵母培养上清中纯化Neuritin重组蛋白。经SDS-PAGE分析显示,Neuritin蛋白得到了有效纯化,纯化后的Neuritin蛋白经Western- blot证实确为Neuritin。5.Neuritin重组蛋白的生物学功能研究结果表明从毕赤酵母中得到的Neuritin重组蛋白有较好的生物学活性:Neuritin既可促进PC12细胞的突起生长,发生类神经元改变;又可促进鸡胚背根神经节的神经纤维生长,延长其存活时间。结论:1.成功构建neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,并从表达产物中纯化得到Neuritin蛋白。2. Neuritin酵母表达蛋白的功能研究结果显示:. Neuritin可促进PC12细胞的突起生长,发生类神经元改变;. Neuritin可促进鸡胚背根神经节神经纤维的生长,延长其存活时间;表明Neuritin有良好的神经生物学功能。本研究为进一步探讨neuritin的生物学功能和神经系统疾病的临床应用奠定了良好的基础。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
英文缩略词表  8-9
前言  9-11
技术路线图  11-12
1. 材料  12-15
  1.1 菌株、质粒和细胞  12
  1.2 主要试剂与酶类  12
  1.3 主要试剂配制  12-14
  1.4 主要仪器设备  14-15
2. 方法  15-22
  2.1 转移载体的构建  15-18
  2.2 毕赤酵母重组子的构建  18-20
  2.3 目的蛋白的诱导表达、纯化与鉴定  20-21
  2.4 表达产物的功能研究  21-22
3. 结果  22-30
  3.1 重组穿梭质粒pPIC9K-neuritin的鉴定  22-23
  3.2 毕赤酵母重组子的鉴定  23-25
  3.3 Neuritin重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定  25-27
  3.4 Neuritin 重组蛋白的功能研究结果  27-30
4. 讨论  30-34
  4.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的选择  30-31
  4.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的构建与筛选  31-32
  4.3 Neuritin重组蛋白的表达、纯化与鉴定  32
  4.4 Neuritin酵母蛋白的生物学功能研究  32-34
5. 结论  34-35
参考文献  35-37
文献综述  37-45
作者简介  45-46
致谢  46-47
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表  47

人Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及表达产物的功能研究

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