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运用基因工程技术构建乳糖发酵短杆菌L-苏氨酸生产菌

作　者: 董迅衍
导　师: 王小元
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: L-苏氨酸 Brevibacterium lactofermentum 代谢工程发酵 lysC hom-thrB
分类号: TQ921
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

L-苏氨酸在食品、饲料、医药和化妆品等领域有着广泛的应用,其市场需求量呈长期稳定增长趋势。微生物发酵法是目前生产L-苏氨酸的主要方式。经多轮反复诱变得到的生产菌株,遗传背景不明,生长缓慢,进一步诱变以提高产量将十分困难且提高空间很小。运用基因工程手段进行菌种改造,将为在现有高产基础上进一步提高L-苏氨酸产量带来新的突破。本论文研究从一株通过传统诱变方法选育得到的Brevibacterium lactofermentum L-异亮氨酸高产菌JHI3-156(L-苏氨酸是L-异亮氨酸生物合成的前体)中克隆出天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶的编码基因lysCM, homM和thrB,通过测序及序列比对分析,确定了lysCM和homM上具有有利于L-苏氨酸积累的突变位点。然后将这些突变基因在野生型B. lactofermentum ATCC13869中表达,研究其对L-苏氨酸积累的影响,构建得到一株L-赖氨酸生产菌和一株L-苏氨酸和L-赖氨酸生产菌。主要研究结果如下：1、确定了lysCM上的突变位点：与野生型相比,lysCM 1186G,1187C缺失,导致其后6个氨基酸残基发生突变,同时导致402位密码子为终止密码子TGA,翻译提前终止；此外还有2个有义突变位点：Ala 279 Thr,Ser 317 Ala。经过对蛋白结构进行分析,发现这些突变与天冬氨酸激酶受L-苏氨酸和L-赖氨酸的协同反馈抑制调节密切相关。Ala 279 Thr突变在L-苏氨酸结合域内,会导致天冬氨酸激酶β亚基与α亚基的调节结构域不能形成稳定的二聚体；Ser 317 Ala突变的意义尚不清楚,但该位点靠近L-赖氨酸结合域；147～152位氨基酸突变及153～172位氨基酸缺失,破坏了调节结构域上ACT 2结构域的特征结构ββαββα；153～172位氨基酸缺失还造成在L-赖氨酸的反馈调节过程中起重要作用的β9(β)股结构缺失。2、确定了homM上的突变位点：与野生型相比,共有5个碱基不同,导致2个有义突变：Gly 148 Ala、Gly 378 Ser。Gly 148 Ala突变位于高丝氨酸脱氢酶的N-端辅酶NAD结合域内,意义尚不清楚；Gly 378 Ser突变位于C-端调节结构域内,对解除高丝氨酸脱氢酶受L-苏氨酸的反馈抑制具有重要作用。3、在B. lactofermentum ATCC13869中,利用表达载体pDXW-8将其自身的野生型lysC、hom和thrB进行共表达,研究了其对L-苏氨酸积累的影响。96 h摇瓶发酵结果表明：L-苏氨酸产量几乎不变,仅由0.045 g/L提高至0.050 g/L。4、在B. lactofermentum ATCC13869中,利用表达载体pDXW-8表达lysCM。96 h摇瓶发酵结果表明：lysCM的表达对提高L-苏氨酸产量作用较小,仅由0.045 g/L提高至0.064 g/L；但使L-赖氨酸产量提高了34倍,由0.209g/L升至7.4 g/L。该重组菌株在3L罐上发酵72 h,L-赖氨酸产量可达40g/L。5、在B. lactofermentum ATCC13869中,利用表达载体pDXW-8表达homM-thrB操纵子。96 h摇瓶发酵结果表明：L-苏氨酸产量提高了3.5倍,由0.045 g/L升至0.202 g/L。6、在B. lactofermentum ATCC13869中,利用表达载体pDXW-8共表达lysCM和homM-thrB。96 h摇瓶发酵结果表明：L-苏氨酸产量提高了17.2倍,由0.045 g/L升至0.820g/L；而L-赖氨酸积累更多,达3.789 g/L。7、对共表达lysCM和homM-thrB的重组菌株13869-3进行初步发酵优化。(1)提高溶氧水平。通过在3L罐上控制溶氧水平：延迟期30%,对数期50%和平稳期30%,13869-3发酵70 h后产4.1 g/L L-苏氨酸和23g/L L-赖氨酸。(2)降低初始糖浓度。通过控制较低的糖浓度：初始糖浓度4.5%和发酵过程2%,13869-3在96 h摇瓶发酵中产3.185 g/LL-苏氨酸和0.923g/L L-赖氨酸。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章前言  9-19
  1.1 引言  9-10
  1.2 C.glutamicum中L-苏氨酸的代谢途径  10-11
    1.2.1 L-苏氨酸生物合成途径  10
    1.2.2 L-苏氨酸的降解代谢途径  10
    1.2.3 L-苏氨酸的跨膜转运系统  10-11
  1.3 C.glutamicum L-苏氨酸合成的调控机制  11-13
    1.3.1 前导肽介导的转录衰减机制  11-12
    1.3.2 合成途径酶的反馈抑制机制  12-13
  1.4 C.glutamicum L-苏氨酸基因工程菌研究进展  13-15
    1.4.1 高效表达L-苏氨酸合成途径关键酶  13-14
    1.4.2 减少L-苏氨酸胞内降解  14
    1.4.3 提高L-苏氨酸向胞外分泌能力  14-15
  1.5 L-苏氨酸代谢工程研究趋势  15-17
    1.5.1 运用系统生物学方法提高产量  15-16
    1.5.2 提高菌株稳定性  16
    1.5.3 扩展底物利用范围  16-17
  1.6 立题背景与意义  17-18
  1.7 论文研究内容  18-19
第二章实验材料与方法  19-26
  2.1 实验材料  19-22
    2.1.1 菌株和质粒  19-20
    2.1.2 引物  20-21
    2.1.3 培养基  21
    2.1.4 主要试剂  21
    2.1.5 仪器设备  21-22
  2.2 实验方法  22-26
    2.2.1 菌体培养及发酵  22
    2.2.2 DNA的制备  22-23
    2.2.3 表达质粒和菌株的构建  23-24
    2.2.4 天冬氨酸激酶的活性测定及纯化  24
    2.2.5 高丝氨酸脱氢酶的活性测定  24-25
    2.2.6 检测及分析方法  25-26
第三章结果与讨论  26-46
  3.1 表达质粒和工程菌株的构建  26-27
    3.1.1 目的基因的PCR扩增  26
    3.1.2 表达质粒的构建及酶切验证  26-27
    3.1.3 工程菌株的构建  27
  3.2 lysC~M突变位点的确定、分析及其活性测定  27-34
    3.2.1 lysC~M的突变位点  27-28
    3.2.2 基于蛋白结构分析lysC~M突变对解除天冬氨酸激酶受反馈抑制调节的影响  28-31
    3.2.3 lysC、lysC~M在E coli BL21中的诱导表达  31-32
    3.2.4 天冬氨酸激酶的纯化  32-33
    3.2.5 天冬氨酸激酶野生型和突变型酶活比较  33-34
    3.2.6 结论  34
  3.3 hom~M突变位点的确定、分析及其活性测定  34-38
    3.3.1 hom~M-thrB的突变位点  35
    3.3.2 hom~M突变的分析  35-36
    3.3.3 hom-thrB在E coli BL21中的诱导表达  36
    3.3.4 高丝氨酸脱氢酶的酶活  36-37
    3.3.5 结论  37-38
  3.4 lysC~M、hom~M-thrB的表达对L-苏氨酸积累的影响  38-44
    3.4.1 lysC~M、hom~M-thrB在pDXW-8上的表达情况  38
    3.4.2 过表达lysC和hom-thrB  38-39
    3.4.3 过表达lysC~M  39-40
    3.4.4 过表达hom-thrB  40-42
    3.4.5 过表达lysC~M和hom~M-thrB  42-43
    3.4.6 结论  43-44
  3.5 工程菌株13869-3的发酵条件优化  44-46
    3.5.1 控制溶氧  44-45
    3.5.2 控制糖浓度  45-46
第四章主要结论与展望  46-48
  4.1 主要结论  46-47
  4.2 展望  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-54
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  54

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