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转基因油菜检测技术与环境安全性研究

作　者: 薄慧杰
导　师: 陈耀锋；卢长明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 转基因抗除草剂油菜转化事件特异性检测蛋白表达基因漂移遗传稳定性
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 237次
引　用: 4次
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内容摘要

Ms8Rf3是由德国拜耳公司利用转基因不育系Ms8(转Barnase与Bar基因)和转基因恢复系Rf3(转Barstar与Bar基因)培育的抗草胺膦杂交油菜,在加拿大的种植面积已占油菜播种总面积的45%以上。近年来,Ms8Rf3种子通过进口贸易,大量输入我国。然而,该品种是否对我国生态环境是否产生不良影响,以及如何对该品种进行检测和监管尚缺乏技术手段和证据。本研究的目的是建立Ms8Rf3转化事件特异性检测方法和ELISA检测手段,评价该品种在我国生态环境中的遗传稳定性以及向我国主要蔬菜和油菜发生基因扩散的可能性,为我国转基因油菜的安全管理提供技术手段和科学依据。根据转基因植物外源基因插入位点的特异性,破译了Ms8Rf3外源基因插入位点两侧的DNA序列,通过设计转化事件特异性引物和构建PCR反应体系,成功构建了针对Ms8Rf3的高效检测体系。该方法能准确判定样品中是否含有来自雄性不育系Ms8、育性恢复系Rf3或者转基因油菜杂交种Ms8Rf3的转基因成分,为转基因油菜监管提供了技术支持并填补了该领域空白。本研究实现了外源基因bar在大肠杆菌中的表达,获得了纯化的PAT蛋白。该蛋白可以替代转基因植物的外源蛋白,用于转bar基因产品的食用安全性分析,也可用于转bar基因产品ELISA检测时的抗体制备。通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后,证实了bar基因分离成功。用BamHI和HindIII酶切,将bar基因与载体pET28a连接,构建成重组载体pET28 bar。将重组载体pET28bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 K Dalton。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。采用人工杂交和荧光显微镜观察甘蓝型油菜花粉在近缘种柱头上的萌发生长情况,探讨了甘蓝型油菜的基因扩散到其它物种的可能性。结果表明,A基因组物种和AB基因组物种与甘蓝型油菜都具有不同程度的亲和性,其中乌塌菜和小叶雪里蕻的亲和指数较高(分别为0.370和0.335)。在大田自然授粉条件下,转基因油菜与相邻种植的芸薹属近缘作物异交率分析表明:13个芸薹属物种中有12个品种不同程度的与Ms8Rf3花期相遇,并且均能检测到异交。天然异交率最高的品种是甘蓝型油菜波利马不育系和中油821(异交率分别是3.598%和0.642%)。为了检测Ms8Rf3的遗传稳定性,本研究对Ms8Rf3的F1代和F2代群体的遗传构成进行了分析。对该品种的除草剂抗性,花粉育性的表达和基因分离规律进行了遗传分

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
引言  9-10
第一章文献综述  10-29
  1.1 全球转基因作物种植概况  10
  1.2 国内外转基因油菜研究与产业化现状  10-12
  1.3 转基因产品的安全性问题  12-13
  1.4 转基因油菜可能存在的潜在风险性分析  13-20
  1.5 转基因油菜的安全性评价内容  20-23
  1.6 转基因油菜产品检测技术研究现状  23-28
  1.7 试验材料背景  28-29
第二章转基因油菜转化事件特异性检测方法研究  29-38
  2.1 材料与方法  30-32
  2.2 结果与讨论  32-38
第三章草胺膦抗性基因Bar 的原核表达与蛋白质纯化  38-44
  3.1 材料与方法  38-40
  3.2 结果  40-42
  3.3 讨论  42-44
第四章转基因油菜外源基因扩散可能性研究  44-56
  4.1 材料与方法  44-46
  4.2 结果与分析  46-53
  4.3 讨论  53-56
第五章转基因油菜M58Rf3 外源基因遗传规律研究  56-66
  5.1 材料与方法  56-58
  5.2 结果与分析  58-62
  5.3 结论  62-66
参考文献  66-73
附录  73-80
致谢  80-81
作者简介  81

转基因油菜检测技术与环境安全性研究

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