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人博卡病毒HBoV结构蛋白基因的克隆、原核表达、纯化及VP1在杆状病毒中的表达

作　者: 陈莹
导　师: 李毅
学　校: 华中师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 呼吸道疾病人博卡病毒结构蛋白基因蛋白表达纯化杆状病毒表达系统
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

下呼吸道感染能引起儿童高发病率,是导致儿童死亡的重要病因之一。在2005年10月瑞典科学家Allander等从下呼吸道感染婴幼儿的分泌物中发现了一种新的细小病毒,它是人支气管炎的一种病原体,该病毒能引起儿童上、下呼吸道感染,甚至可引起严重的呼吸道疾病。从分子生物学、系统发育树分析和流行病学等多方面综合研究表明,该病毒具有细小病毒亚科的基本特征,并与细小病毒亚科的博卡病毒属成员结构特征相似,从而将其归类为博卡病毒属的新成员,并命名为人博卡病毒。人博卡病毒是一种无包膜的、单链DNA病毒,基因组DNA长度大约5299 nt,它是继细小病毒B19之后发现的第二种对人类致病的细小病毒,到目前为止已有18个国家和地区的研究者证实了人博卡病毒感染在儿童呼吸道疾病中普遍存在,部分研究者还在血清、粪便以及尿液的标本中也检测到了人博卡病毒,推测该病毒与胃肠道疾病有关。人博卡病毒可以单独感染,也可以与其他病毒混合感染,感染可全年发生,但深秋、冬季和早春为感染多发季节。目前对人博卡病毒生物学特性及其在人类疾病中的意义仍不清楚。本文根据我们实验室克隆得到的大片段人博卡病毒序列设计VP1和VP2引物(该序列已经提交GeneBank,登录号为：GU 139423),通过PCR扩增得到结构蛋白基因。并将VP1和VP2基因分别都克隆到原核表达载体pMAL-c2X和pET28a,转化大肠杆菌DH5α和BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Westen Blot检测目的蛋白的表达。利用Amylose亲和层析柱和Ni柱纯化目的蛋白,并用纯化后得到的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,从而为进一步研究该病毒结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具。此外,为了弄清楚结构蛋白VP1独特区(VP1-u)是否可以单独表达,还是从整个结构蛋白VP1表达后被裂解下来的。本实验将人博卡病毒主要衣壳蛋白基因VP1克隆到杆状病毒表达转移载体(pFastBacHTA),通过转座获得重组Bacmid DNA,用这种DNA转染昆虫细胞Sf9,转染7到10天细胞完全破裂后,扩大培养使重组病毒达到一个比较高的滴度,收获重组病毒粒子,分别应用His-tag抗体和兔抗HBoVVP1-U高价免疫血清进行Western Blot,以检测VP1蛋白除了自身表达外,它所包含的VP1-U蛋白是否也进行了表达。结果表明VP1独特区不能单独表达。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-22
  1.1 人博卡病毒HBoV的简介  10-15
    1.1.1 人博卡病毒的发现、命名及分类  10
    1.1.2 人博卡病毒染色体组分析  10-13
    1.1.3 人博卡病毒的流行病学特征  13-14
    1.1.4 人博卡病毒感染后的临床症状  14-15
    1.1.5 人博卡病毒的诊断、检测方法  15
    1.1.6 人博卡病毒的致病机理  15
  1.2 pMAL~(TM)原核表达系统(参考NEB公司pMAL~(TM)蛋白融合和纯化系统手册)  15-17
    1.2.1 pMAL~(TM)原核表达系统简介  15-16
    1.2.2 质粒pMAL-c2X(Amp抗性)的相关信息及克隆策略  16-17
  1.3 pET原核表达系统(参考Novagen公司第10版pET系统操作手册)  17-19
    1.3.1 pET原核表达系统简介  17
    1.3.2 质粒pET28a(Kan抗性)的相关信息及克隆策略  17-18
    1.3.3 原核表达载体pET28a克隆及表达的基本流程  18-19
  1.4 Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统(参考Ivitrogen公司Bac-to-Bac(?)Baculovirus Expression System操作手册)  19-20
    1.4.1 Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统简介  19
    1.4.2 Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统pFastBac载体  19-20
    1.4.3 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的原理  20
  1.5 本文研究的目的和意义  20-22
2 实验材料和方法  22-33
  2.1 主要实验仪器  22
  2.2 主要实验材料  22-24
    2.2.1 菌株、质粒和细胞  22
    2.2.2 药品和试剂  22-23
    2.2.3 细菌培养基与试剂配制  23
    2.2.4 常用溶液及配制  23-24
  2.3 实验方法  24-33
    2.3.1 DNA的提取  24-25
    2.3.2 VP1和VP2目的基因的PCR扩增  25-26
    2.3.3 DNA片段的切胶回收  26-27
    2.3.4 含VP1和VP2序列重组质粒的构建  27-28
    2.3.5 阳性克隆的筛选和鉴定  28
    2.3.6 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测  28
    2.3.7 融合蛋白经Western Blot检测  28-29
    2.3.8 诱导表达条件的优化  29
    2.3.9 pMAL-c2X-VP2融合蛋白的分离纯化  29-30
    2.3.10 HBoV-VP2多克隆抗体的制备  30
    2.3.11 Western Blot检测抗体免疫学活性  30
    2.3.12 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统检测VP1基因的表达  30-33
3 实验结果  33-44
  3.1 以pMAL-c2X为载体进行结构蛋白的原核表达、纯化  33-36
    3.1.1 VP1和VP2的PCR扩增  33
    3.1.2 重组质粒pMAL-c2X-VP1和pMAL-c2X-VP2的双酶切鉴定  33-34
    3.1.3 重组质粒的序列测定  34
    3.1.4 SDS-PAGE检测融合蛋白的原核表达  34
    3.1.5 Western-Blot检测融合蛋白的原核表达  34-35
    3.1.6 pMal-c2x-VP2融合蛋白纯化后的检测  35
    3.1.7 pMal-c4x-VP2融合蛋白的诱导表达及Western Blot检测  35-36
  3.2 以pET28a为载体进行结构蛋白的原核表达、纯化  36-40
    3.2.1 VP1和VP2的PCR扩增  36
    3.2.2 重组质粒pET28a-VP1和pET28a-VP2的双酶切鉴定  36-37
    3.2.3 SDS-PAGE检测融合蛋白的原核表达  37
    3.2.4 Western Blot检测融合蛋白的原核表达  37-38
    3.2.5 pET28a-VP2融合蛋白纯化后的检测  38
    3.2.6 Western Blot检测纯化后的融合蛋白  38-39
    3.2.7 重组质粒pET28a-VP2的序列测定  39
    3.2.8 重新构建重组质粒pET28a-VP2  39
    3.2.9 SDS-PAGE检测融合蛋白的诱导表达  39-40
  3.3 VP1蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的表达  40-44
    3.3.1 VP1序列的PCR扩增(以pFastBac HTA载体)  40
    3.3.2 pFastBac HTA-VP1重组质粒酶切鉴定  40-41
    3.3.3 pFastBac HTA-VP1重组质粒序列测定  41
    3.3.4 pFastBac HTA-VP1重组质粒转座及鉴定  41-42
    3.3.5 重组Bacmid DNA转染Sf9细胞  42
    3.3.6 扩大培养  42-43
    3.3.7 Western Blot检测VP1基因和VPl-u基因的表达  43-44
4 讨论和展望  44-48
  4.1 讨论及结果分析  44-46
    4.1.1 以pMAL-c2X和pET28a分别为载体构建含目的基因重组质粒  44
    4.1.2 结构蛋白的原核表达与纯化  44-46
    4.1.3 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统检测VP1、VP1-u基因的表达  46
  4.2 总结和展望  46-48
参考文献  48-52
硕士期间发表论文  52-53
致谢  53-54

人博卡病毒HBoV结构蛋白基因的克隆、原核表达、纯化及VP1在杆状病毒中的表达

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