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无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌GapC蛋白的表达与免疫原性研究

作　者: 车车
导　师: 朱战波
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 链球菌奶牛乳房炎 GapC蛋白表达免疫
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 77次
引　用: 1次
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内容摘要

链球菌(Streptococcus)是引起奶牛乳房炎的重要病原菌。由于不同血清群和血清型的链球菌抗原性较复杂,目前研究的无乳链球菌(S.agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、乳房链球菌(S.uberis)疫苗在保护由链球菌引起的奶牛乳房炎方面,其临床应用效果并不理想。研究表明具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的蛋白是细菌、真菌和寄生虫感染的最佳疫苗靶向。因而,本研究克隆表达S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis表面具有GAPDH活性的保守性GapC蛋白,制备免疫原,探讨其免疫原性及其对三种链球菌感染的交叉免疫保护作用。本研究首先通过细菌形态、培养特性、生化试验和PCR种属分析对13株奶牛乳房炎链球菌分离株进行鉴定和致病性研究。然后通过PCR方法扩增S.agalactiae LS0310株,S.dysgalactiae LS0312株,S.uberis SD0306株的gapC基因,随后分别克隆到pMD18-T载体上。重组克隆经测序和序列对比分析后。将gapC基因插入到pQE-30表达载体上,转化至大肠杆菌XL-1-Blue,IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定TRGapC、WRGapC、RFGapC融合蛋白的表达并确定其GAPDH活性。150只健康小白鼠随机分成15组,分别用重组蛋白、全菌体灭活菌苗及对照组(PBS)对其进行免疫。Western-blot检测重组蛋白的特异性抗体结合活性。应用ELISA方法,检测各组小鼠血清中IgG抗体水平;应用微量凝集试验检测3种GapC蛋白免疫血清对S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis分离株的交叉凝集反应;在二免后第21d用S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis分离株对三组蛋白免疫组及全菌体免疫组进行攻毒,攻毒后根据小白鼠的存活率和细菌分离情况,评价3种GapC蛋白的交叉免疫保护效果。结果在13株奶牛乳房炎分离株中鉴定出2株停乳链球菌、2株乳房链球菌、5株无乳链球菌。成功扩增并克隆了S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis3个分离菌株的gapC基因,与GenBank上的核苷酸序列一致性分别为96%、94.9%、99.9%。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pQE-30/TRGapC、pQE-30/WRGapC、pQE-30/RFGapC在E. coli XL-1-Blue中成功表达,GAPDH活性检测及Western Blot检测表明重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原性。三组蛋白免疫组及全菌体组小鼠血清中抗IgG抗体水平在加强免疫后第21d均达到最高值;微量凝集试验结果表明三组GapC蛋白抗血清与3株菌株产生了特异性的凝集反应,证明三组GapC蛋白抗血清具有与三株链球菌菌株产生抗原抗体反应的能力。全菌体血清只有S.agalactiae与S.dysgalactiae发生凝集。攻毒试验结果表明TRGapC蛋白免疫组对三种菌株的保护率很高,对S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis的攻击保护率分别为80%、90%、100%,而全菌体免疫组的保护率不高,保护率为40%或50%。综上所述,表达的3种GapC重组蛋白都具有GAPDH活性、免疫原性,对S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis感染有较好的交叉免疫保护作用。可作为深入研究Streptococcus基因工程疫苗的良好靶向。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章文献综述  9-20
  1.1 引言  9
  1.2 奶牛乳房炎的病原种类  9-10
  1.3 链球菌的致病机制  10-12
  1.4 链球菌的表面抗原  12-14
  1.5 链球菌疫苗的研究进展  14-17
  1.6 链球菌GapC 的特性与应用  17-19
  1.7 本研究的目的和意义  19-20
第二章材料与方法  20-32
  2.1 材料  20-21
  2.2 方法  21-32
第三章试验结果  32-50
  3.1 菌种主要生物学特性及PCR 鉴定结果  32-34
  3.2 Streptococcus gapC 基因的PCR 扩增结果  34-35
  3.3 gapC 基因的T-A 克隆结果  35-37
  3.4 gapC 基因的序列分析结果  37-40
  3.5 gapC 基因重组表达载体构建结果  40-42
  3.6 重组GapC 蛋白的表达及纯化结果  42-43
  3.7 重组GapC 蛋白的GAPDH 活性测定结果  43-44
  3.8 Western Blot 检测重组蛋白的抗原性  44-45
  3.9 免疫血清的微量凝集试验结果  45
  3.10 重组GapC 蛋白的免疫原性检测结果  45-48
  3.11 动物保护性试验结果  48-50
第四章讨论  50-52
第五章结论  52-53
参考文献  53-58
致谢  58-59
附录  59-70
作者简历  70

无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌GapC蛋白的表达与免疫原性研究

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