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单环刺螠硫醌氧化还原酶相互作用蛋白质的筛选

作　者: 谭志
导　师: 张志峰
学　校: 中国海洋大学
专　业: 遗传学
关键词: 单环刺螠硫醌氧化还原酶蛋白表达纯化 His-pulldown 质谱
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 15次
引　用: 1次
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内容摘要

硫化物对于多数生物是有毒的,其主要表现为可以抑制线粒体电子传递链细胞色素氧化酶的活性,从而阻止有氧呼吸的进行。近年来,人们发现一些沿岸底栖生物可以氧化硫化物使之成为低毒或无毒的产物,以减低或解除硫化物毒性。硫醌氧化还原酶(Sulfide:quinone oxidoreductase, SQR)被认为是这一氧化过程的关键酶。本文对我国沿海分布的单环刺螠(Urechis unicinctus) SQR可能的相互作用蛋白进行了筛选和初步的定性,为深入揭示硫化物的氧化代谢机制研究提供基础数据。采用pET28a(+)表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌中体外表达出包涵体形式的单环刺螠6His-SQR;后采用稀释复性法获得具有较高酶学活性(5.04μmol/min/mg)的单环刺螠6His-SQR;首次采用His-pulldown技术,使用饱和结合于Ni2+-NTA树脂上的单环刺螠6His-SQR(1mL Ni柱可结合3mg 6His-SQR),从50μM硫化物处理的单环刺螠体壁蛋白提取液中钓取了2个可能与SQR相互作用的蛋白质,其分子量分别约为40 ku和60 ku；经毛细管液相色谱-离子肼质谱分析,初步判断这两种蛋白质为细胞色素P450 (cytochrome P450)和腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter),随后对两种蛋白可能的功能进行了探讨。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章前言  10-31
  1 生物对硫化物耐受的研究概况  10-17
    1.1 硫化物的毒性  11-12
    1.2 真核生物对硫化物的耐受  12-17
  2 硫醌氧化还原酶研究进展  17-20
    2.1 SQR的细胞学定位  17-18
    2.2 SQR催化最初产物为过硫化物  18
    2.3 SQR酶活中心的保守氨基酸  18-19
    2.4 SQR催化特性  19-20
    2.5 硫化物利用、耐受与解毒  20
  3 刺螠动物硫化物耐受的研究概况  20-22
    3.1 美洲刺螠的硫化物耐受研究  21
    3.2 单环刺螠硫化物耐受研究  21-22
  4 蛋白质相互作用的研究方法  22-29
    4.1 酵母双杂交技术及其应用  23-24
    4.2 免疫共沉淀技术及其应用  24-26
    4.3 Pull down技术及其应用  26-28
    4.4 噬菌体展示技术及其应用  28
    4.5 蛋白质芯片技术及其应用  28-29
    4.6 荧光共振能量转移(FRET)技术及其应用  29
  5 本论文研究的意义  29-31
第二章单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化及复性  31-46
  1 材料与方法  31-40
    1.1 实验材料  31-33
      1.1.1 菌株、载体  31-32
      1.1.2 酶类、分子量标准及其它试剂  32
      1.1.3 仪器设备  32-33
    1.2 实验方法  33-40
      1.2.1 pET28a(+)/SQR原核表达载体的构建  33-36
      1.2.2 单环刺螠6His-SQR蛋白的体外原核表达  36-37
      1.2.3 单环刺螠6His-SQR蛋白的纯化  37-39
      1.2.4 单环刺螠6His-SQR蛋白的复性  39
      1.2.5 对已复性的单环刺螠6His-SQR蛋白进行浓缩  39-40
  2 结果  40-44
    2.1 pET28a(+)/SQR原核表达载体的构建  40-41
    2.2 pET28a(+)/SQR重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)  41
    2.3 单环刺螠6His-SQR蛋白的体外原核表达  41-42
    2.4 单环刺螠6His-SQR蛋白的纯化  42-43
    2.5 单环刺螠6His-SQR蛋白的复性  43-44
  3 讨论  44-46
第三章单环刺螠硫醌氧化还原酶相互作用蛋白质的筛选  46-55
  1 材料与方法  46-50
    1.1 实验材料  47
      1.1.1 实验动物  47
      1.1.2 主要试剂的配制  47
    1.2 实验方法  47-50
      1.2.1 单环刺螠的硫化物处理和取样  47-48
      1.2.2 Ni~(2+)-NTA树脂饱和结合单环刺螠6His-SQR蛋白  48-49
      1.2.3 单环刺螠体壁组织细胞裂解液的制备  49
      1.2.4 His-pulldown实验  49-50
      1.2.5 毛细管液相色谱-离子肼质谱分析与单环刺螠6His-SQR互作的蛋白质  50
  2 结果  50-53
    2.1 单环刺螠6His-SQR互作蛋白质的筛选  50-52
    2.2 单环刺螠6His-SQR互作蛋白的质谱分析  52-53
  3 讨论  53-55
结论  55-56
参考文献  56-67
附录  67-69
致谢  69-70
个人简历  70
发表的学术论文  70

单环刺螠硫醌氧化还原酶相互作用蛋白质的筛选

内容摘要

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