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白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒类凝血酶基因序列分析和真核表达

作　者: 宋锡迅
导　师: 余晓东
学　校: 重庆师范大学
专　业: 动物学
关键词: 白唇竹叶青蛇毒类凝血酶纤维蛋白原克隆毕赤酵母表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蛇毒内包含有多种能够作用血栓和止血的酶类。其中的蛇毒类凝血酶(SVTLEs)在体内能裂解纤维蛋白肽A,部分还同时裂解B肽,类凝血酶不会激活因子XIII,所产生的纤维蛋白聚合物分子间只在头尾连接。在体外,类凝血酶可裂解纤维蛋白原,使纤维蛋白原变成纤维蛋白,从而产生凝血作用;在体内,类凝血酶则可以消耗纤维蛋白原,降低血液粘度,从血流变学方面改善微循环,从而起到抗栓的作用,因此已在临床上应用于治疗血栓等疾病。目前临床上应用的SVTLEs制剂多来自于蛇毒纯化,数量、成本上存在局限,用基因工程技术方法可解决上述问题。本研究以重庆产白唇竹叶青为对象,根据已知竹叶青属中的类凝血酶cDNA序列,设计上下游引物,提取毒腺总RNA为模板进行RT- PCR,扩增得到一个约805 bp的条带,纯化回收此条带,并克隆至pMD18-T载体并测序,获得该类凝血酶cDNA序列,该序列除合成5’和3’末端引物外,还有一条长为777 bp的编码序列(chitribrisin)。将此序列与本实验室获得的chitribrisin序列进行比对。本实验室曾经在大肠杆菌中表达过chitribrisin,但获得包涵体生物活性较低。此次研究将chitribrisin基因亚克隆到毕赤酵母菌表达载体pPICZαA中,在AOX1启动子下表达蛋白,经电转化转化至宿主菌X-33中,甲醇诱导96小时后收获表达上清。经除盐和亲和层析分离纯化后最终获得分子量约为52 KD左右的单一蛋白条带。在960ml上清中收集到46 mg目标蛋白。进行性质鉴定,发现其生物活性较大肠杆菌的表达产物要高,其可降解纤维蛋白原的α和β链,不能降解γ链。与大肠杆菌表达结果一致。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-9
1 引言  9-12
  1.1 研究背景及意义  9-10
  1.2 研究的主要内容  10
  1.3 研究的技术路线  10-12
2 chitribrinsin 基因序列分析与构建 pPICZαA/ chitribrisin 重组载体  12-31
  2.1 实验材料  12-15
  2.2 引物设计  15-16
  2.3 试验方法  16-24
  2.4 结果与分析  24-29
  2.5 讨论  29-31
3 chitribrinsin 基因真核表达、纯化和活性鉴定  31-49
  3.1 实验材料  31-34
  3.2 试验方法  34-42
  3.3 实验结果  42-47
  3.4 讨论  47-49
4 全文总结  49-51
5 文献综述  51-59
参考文献  59-63
附件 A 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况  63-64
附件 B 英文缩写一览表  64-65
致谢  65

白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒类凝血酶基因序列分析和真核表达

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