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基于芳香烃受体系统的痕量二恶英生物检测方法的研究

作　者: 王卓
导　师: 张万起；吴蕴棠
学　校: 天津医科大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 芳香烃受体 芳香烃受体核转位蛋白 原核表达 亲和纯化 多克隆抗体 二恶英(TCDD) 免疫印迹
分类号: Q503
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的采用分子生物和生物化学技术,依据芳香烃受体(AhR)在二恶英的活化作用下能与芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)特异性结合的分子机制。本课题旨在探索一种基于芳香烃受体系统的快速、简便、经济且特异性很强的二恶英生物检测方法。方法(1)以小鼠肝组织中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增目的基因,DNA测序分析验证后,利用pGEX-5X-1表达质粒,构建AhR和ARNT全长及相应片段AhR-PAS、AhR-C和ARNT-PAS共5个蛋白的重组表达质粒。酶切鉴定后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中,在该原核系统中大量表达目的蛋白质,采用谷光甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione SepharoseTM 4B)亲和层析纯化GST-融合蛋白或利用凝血因子Xa对融合蛋白的进行酶切获得目的蛋白质。(2)利用AhR-PAS和AhR-C这两个特异性片段蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。(3)从C57BL/6J纯系小鼠肝组织中提取具有结合活性的天然AhR,采用Bradford法对总蛋白进行定量,计算出其中AhR的含量。(4)将天然AhR与GST-ARNT、GST-ARNT-PAS以等摩尔的比例混合,在室温下与不同剂量的TCDD进行温育结合。将结合了的GST-ARNT-AhR复合物用Glutathione Sepha-roseTM 4B珠子进行亲和吸附,并用结合缓冲液洗去非特异性结合蛋白。最后采用免疫印迹(Western Blot)等方法,以AhR-PAS或AhR-C两种蛋白制得的多克隆抗体作为检测所需的一抗,研究AhR与融合蛋白ARNT、ARNT-PAS结合的条件、程度及剂量反应关系,从而对TCDD进行定量分析。结果(1)成功地克隆了目的基因并在原核系统中表达了相应蛋白；(2)免疫家兔获得2种高效价的多克隆抗体,免疫印迹的检测下限分别是1 ng和5ng；(3)从C57BL/6J纯系小鼠肝组织中提取出具有结合活性的天然AhR,其浓度为3-7.2pmol/ml cytosol;(4)克隆蛋白与天然AhR在TCDD存在的前提下温育结合,免疫印迹足以检测到0.25 pmolTCDD；(5)在克隆蛋白与天然AhR充足的情况下,免疫印迹中的一抗所识别AhR的量随着TCDD剂量的增加而增加(呈剂量反应关系)。结论本课题应用免疫学和分子生物学等相关技术,为建立基于芳香烃受体系统的痕量二恶英生物检测方法提供了重要的研究基础与相关材料。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语  10-11
第一章 前言  11-19
  第一节 二恶英的研究概况  11-14
  第二节 二恶英类化学物质的毒性机理  14-17
    一、芳香烃受体和芳香烃受体核转位蛋白  14
    二、芳香烃受体介导的基因表达的过程  14-16
    三、芳香烃受体介导的蛋白激酶途径  16-17
  第三节 本课题的基本思想  17-19
第二章 人工克隆蛋白的制备  19-45
  第一节 实验材料与方法  19-32
    一、材料  19-25
    二、方法  25-32
  第二节 实验结果  32-37
    一、重组质粒的双酶切鉴定  32
    二、目的蛋白诱导前后的鉴定  32-34
    三、目的蛋白表达的细胞内定位分析  34-36
    四、目的蛋白的大量表达与分离纯化  36-37
  第三节 讨论  37-45
    一、RT-PCR扩增目的基因  37-40
    二、构建重组表达质粒  40-42
    三、目的蛋白的诱导表达与分离纯化  42-45
第三章 多克隆抗血清的制备  45-57
  第一节 实验材料与方法  45-50
    一、材料  45-46
    二、方法  46-50
  第二节 实验结果  50-54
    一、抗原的制备  50-51
    二、免疫家兔制备多克隆抗体  51
    三、多克隆抗体的效价分析  51-54
  第三节 讨论  54-57
    一、实验动物的选择  54
    二、多克隆抗体的制备和效价分析  54-57
第四章 动物体内天然芳香烃受体相关蛋白的提取  57-64
  第一节 实验材料与方法  57-60
    一、材料  57-58
    二、方法  58-60
  第二节 结果  60-62
  第三节 讨论  62-64
    一、实验动物与组织的选择  62
    二、缓冲溶液的选择  62-64
第五章 人工表达融合蛋白与天然芳香烃受体蛋白结合情况的研究  64-73
  第一节 实验材料与方法  64-66
    一、材料  64-65
    二、方法  65-66
  第二节 结果  66-67
  第三节 讨论  67-73
    一、目的蛋白的结构与功能  67-69
    二、结合条件的选择  69-70
    三、检测二恶英  70-72
    四、进一步的研究方向  72-73
第六章 结论  73-74
参考文献  74-80
在学期间发表论文情况  80-81
致谢  81

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 一般性问题 > 生物化学技术
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