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黑曲霉EIM-6聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和表达

作　者: 强慧妮
导　师: 黄建忠；田宝玉
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶生物信息学分析异源表达共发酵
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 28次
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内容摘要

聚半乳糖醛酸酶是果胶降解酶系中比较重要的一个组分,它在工业,农业等的多个领域都有广泛的用途。本实验以一株产果胶酶的黑曲霉EIM-6菌株为出发菌株,克隆到黑曲霉聚半乳糖醛酸酶基因并成功实现在毕赤酵母中的表达,然后开展了聚半乳糖醛酸酶增效研究。以提取的黑曲霉总基因组为模板,克隆聚半乳糖醛酸酶基因,Blast比对结果表明,聚半乳糖醛酸酶基因的保守性很高,基因内部约200-250bp的位置为内含子区域,成熟肽基因序列全长为1113bp,可以翻译成370个氨基酸,分子量为38kD。进一步对聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列、氨基酸组成、疏水作用、空间结构等方面进行了分析和预测,各个家族的聚半乳糖醛酸酶具有非常保守的作用位点,而且它有明显的信号肽可以实现分泌表达。以克隆的聚半乳糖醛酸酶基因组基因为模板,设计引物,利用多引物重叠延伸PCR的方法克隆得到成熟肽基因。分别构建原核表达载体pET-30a-pga和真核表达载体pPIC3.5K-pga,转化相应宿主大肠杆菌BL21和巴斯德毕赤酵母GS115,诱导表达。结果显示表达的重组聚半乳糖醛酸酶蛋白在大肠杆菌细胞中以无活性的包涵体形式存在着,且难以实现酶的复性。在毕赤酵母GS115中的表达则成功的分泌出了分子量大小约为38kD且有活性的聚半乳糖醛酸酶蛋白,初步测定酶活为560个单位。经分析其最适反应温度为50℃,最适pH为4.0,与野生的酶特性一致。利用获得的聚半乳糖醛酸酶基因重组菌株,进一步开展聚半乳糖醛酸酶对整个果胶酶系其他组分的共发酵和增效研究。在黑曲霉聚半乳糖醛酸酶和裂解酶基因工程菌株的共发酵研究中,初步发现当二者的接种量相等时,各成分在甲醇诱导的过程中,最佳的产酶时间没有改变,而且从果胶板的水解圈验证可以看出,二者共发酵的发酵液的水解圈颜色明显比二者单独培养的发酵液的水解圈的颜色要深。而且对二者共发酵产物,进行各自的酶学特性研究发现和单独培养时相比也没有发生改变。结果表明果胶降解酶中的聚半乳糖醛酸酶和裂解酶两个组分的协同作用效果要大于单独组分。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-8
目录  8-10
绪论  10-24
  第一节课题背景  10-11
  第二节果胶酶  11-15
  第三节聚半乳糖醛酸酶及其克隆表达研究  15-21
  第四节课题研究内容、目的及意义  21-24
第一章黑曲霉EIM-6聚半乳糖醛酸酶基因的克隆  24-34
  第一节前言  24
  第二节材料与方法  24-26
  第三节结果与分析  26-32
  第四节小结与讨论  32-34
第二章聚半乳糖醛酸酶基因的生物信息学分析  34-46
  第一节前言  34
  第二节材料与方法  34-35
  第三节结果与分析  35-44
  第四节小结与讨论  44-46
第三章黑曲霉EIM-6聚半乳糖醛酸酶基因的异源表达  46-66
  第一节前言  46
  第二节材料与方法  46-53
  第三节结果与分析  53-63
  第四节小结与讨论  63-66
第四章黑曲霉聚半乳糖醛酸酶和裂解酶基因工程菌株的共发酵研究  66-76
  第一节前言  66
  第二节材料与方法  66-69
  第三节结果与分析  69-74
  第四节小结与讨论  74-76
第五章结论与展望  76-78
附录  78-80
参考文献  80-88
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  88-90
致谢  90-92
个人简历  92

黑曲霉EIM-6聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和表达

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