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贯叶连翘的固体发酵工艺及电子束辐照研究

作　者: 靳振召
导　师: 梁剑平
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 贯叶连翘黑曲霉发酵工艺电子束辐照
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

在中药提取过程中,细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时,必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力,贯叶连翘的有效成分被包裹在由纤维素、半纤维素和木质素等构成的细胞壁中,不利于有效成分的提取。基于纤维素酶能促进中草药有效成分提取的研究基础上,本实验采用黑曲霉发酵的方法,通过降解贯叶连翘中的粗纤维含量,从而促进贯叶连翘中金丝桃素和金丝桃苷的提取。本论文以提高发酵后贯叶连翘中金丝桃素和金丝桃苷的含量为目的,首先采用高效液相色谱建立了金丝桃素和金丝桃苷的含量测定方法,其次,研究黑曲霉发酵贯叶连翘的最佳发酵工艺,最后,采用电子束对贯叶连翘及其发酵物进行辐照研究。本课题的主要研究内容如下:1.金丝桃素反相高效液相色谱法的建立。优化所得最佳色谱条件为:Agilent HC-C18（5μm,4.6 mm×250 mm）,乙腈︰甲醇︰乙酸铵缓冲液（0.30 mol/L,冰醋酸调pH值至4.0）=50︰40︰10,检测波长588 nm,流速1 mL/min,进样量20μL,柱温25℃。金丝桃素保留时间在11.0 min,含量测定标准曲线方程为Y=3×106X-144070（r=0.9999）;线性范围,0.0512μg/mL～10.0μg/mL;加样回收率在94.55%-101.07%;其它各项方法学指标如稳定性、精密度、重现性等均符合药典规定,能够满足该药的分析测定。2.金丝桃苷反相高效液相色谱法的建立。优化所得最佳色谱条件:即依利特Hypersil ODS2（5μm,4.6 mm×250 mm）,乙腈︰四氢呋喃︰0.1%磷酸=17︰10︰73,检测波长360 nm,流速1.0 mL/min,进样量20μL,柱温25℃。金丝桃苷保留时间在8.6 min左右,含量测定标准曲线方程为Y=473282X+3×10⁶（r=0.9989）;线性范围,6.547μg/mL-50.520μg/mL;加样回收率在95.03%-100.32%之间;其它各项方法学指标均符合要求,说明该方法适宜做金丝桃苷的含量测定。3.黑曲霉发酵贯叶连翘。采用单因素试验设计,考察了固体发酵的温度、初始pH、时间、料液比、葡萄糖含量、接种量和表面活性剂Tween80等7个因素对金丝桃素和金丝桃苷含量的影响。并采用L₁₆（4⁵）正交试验,考察温度、初始pH、料液比、接种量和葡萄糖含量等5个因素对黑曲霉发酵贯叶连翘的综合影响,确定了最佳的发酵工艺。最佳的发酵工艺是:称取10 g贯叶连翘粉,按1:2的比例加入20 mL Mandels液（葡萄糖含量为5%,pH为5.5）,接种1 mL种子液,发酵96 h,0 h-24 h在30℃下发酵,25 h -96 h在25℃下发酵。结果发现,发酵后粗纤维含量降低16.74%,金丝桃素含量增加了26.53%,金丝桃苷含量增加了22.46%。通过对比发酵与未发酵贯叶连翘的提取物中金丝桃素和金丝桃苷的总量发现,贯叶连翘经过发酵后,其提取物中金丝桃素总量增加了22.79 mg（24.02%）,金丝桃苷总量增加了76.68 mg（19.56%）。4.发酵产物的电子束辐照研究。首先考察了不同辐照剂量对贯叶连翘发酵物中微生物数量的影响,并依据微生物存活对数与辐照剂量的线性关系,确定D₁₀值。其次研究了6.0 kGy剂量辐照下贯叶连翘发酵物中微生物的生长情况,结果表明,发酵物经过6.0 kGy的剂量辐照后,可以保存60 d,其卫生指标仍达到国家药典中规定的含发酵成分药材的微生物限度标准。最后,通过对贯叶连翘提取物2和4的比较表明,经过辐照能显著提高贯叶连翘提取物中金丝桃素总量,金丝桃素总量增加了11.08 mg（9.42%）;通过对贯叶连翘提取物1和4的比较表明,贯叶连翘经过黑曲霉发酵和电子束辐照共同作用,能最大限度的提高提取物中的金丝桃素和金丝桃苷含量,金丝桃素总量提高了33.87 mg（35.71%）,金丝桃苷总量提高了82.96 mg（21.15%）。本论文为提高贯叶连翘中有效成分的提取率,首次进行了贯叶连翘的黑曲霉发酵和电子束辐照研究,优化了固体发酵的工艺参数,并找到了合适的辐照剂量,使贯叶连翘中有效成分金丝桃素和金丝桃苷含量明显增高。这些研究的开展将为中兽药的开发利用提供新的方法。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-10
第一章前言  10-23
  1.1 贯叶连翘中的有效成分及药理活性  10-12
    1.1.1 贯叶连翘中有效成分的研究  10-11
    1.1.2 贯叶连翘的药理学活性  11-12
  1.2 中药发酵炮制  12-19
    1.2.1 中药炮制简述  12-13
    1.2.2 中药发酵炮制的研究进展  13-15
    1.2.3 中药固体发酵炮制  15-16
    1.2.4 纤维素酶及其在中药提取中的应用  16-19
  1.3 辐照技术在中药中应用的研究进展  19-21
  1.4 研究的目的与意义  21-23
第二章贯叶连翘中金丝桃素和金丝桃苷含量测定方法的建立  23-36
  2.1 仪器  23
  2.2 对照品与试剂  23
  2.3 金丝桃素含量测定方法的建立  23-30
    2.3.1 色谱柱、检测波长、流速和柱温的确定  23
    2.3.2 对照品储备液制备  23-24
    2.3.3 样品提取液制备  24
    2.3.4 滤膜的选择  24
    2.3.5 流动相条件的摸索  24-27
    2.3.6 线性关系考察  27-28
    2.3.7 精密度试验  28
    2.3.8 稳定性试验  28-29
    2.3.9 重现性试验  29
    2.3.10 样品回收率试验  29-30
  2.4 金丝桃苷含量测定方法的建立  30-35
    2.4.1 色谱柱、检测波长、流速和柱温的确定  30
    2.4.2 对照品储备液制备  30
    2.4.3 样品提取液制备  30
    2.4.4 流动相条件的选择  30-32
    2.4.5 线性关系考察  32-33
    2.4.6 精密度试验  33
    2.4.7 稳定性试验  33-34
    2.4.8 重现性试验  34
    2.4.9 样品回收率试验  34-35
  2.5 讨论  35-36
    2.5.1 金丝桃素性质与色谱行为关系  35
    2.5.2 改变流动相成分和比例，提高分离度  35-36
第三章黑曲霉固体发酵贯叶连翘最佳工艺的选择  36-56
  3.1 材料  36-37
    3.1.1 样品  36
    3.1.2 菌种  36
    3.1.3 培养基  36-37
    3.1.4 试剂  37
    3.1.5 仪器与设备  37
  3.2 方法  37-39
    3.2.1 菌种培养方法  37-38
    3.2.2 金丝桃素和金丝桃苷的含量测定方法  38
    3.2.3 粗纤维的含量测定[72]  38-39
    3.2.4 贯叶连翘提取物的提取方法  39
  3.3 结果与分析  39-53
    3.3.1 各因素对发酵贯叶连翘中金丝桃素和金丝桃苷含量的影响  39-48
    3.3.2 发酵条件的正交试验  48-51
    3.3.3 不同发酵时间下贯叶连翘中粗纤维及金丝桃素和金丝桃苷的含量测定结果  51-52
    3.3.4 贯叶连翘和贯叶连翘发酵物中金丝桃素和金丝桃苷提取总量的比较  52-53
  3.4 讨论  53-56
    3.4.1 发酵方式的影响  53
    3.4.2 温度的影响  53
    3.4.3 发酵时间的影响  53-54
    3.4.4 料液比的影响  54
    3.4.5 初始pH 的影响  54
    3.4.6 接种量的影响  54
    3.4.7 葡萄糖浓度的影响  54-55
    3.4.8 表面活性剂浓度的影响  55
    3.4.9 发酵对有效成分提取的影响  55-56
第四章贯叶连翘发酵品的电子束辐照研究  56-64
  4.1 材料  56
    4.1.1 试验材料与试剂  56
    4.1.2 仪器和设备  56
  4.2 方法  56-57
    4.2.1 样品辐照  56
    4.2.2 样品性状观察  56
    4.2.3 样品中微生物的测定  56-57
    4.2.4 杀菌效果考察  57
    4.2.5 样品中有效成分的分析方法  57
    4.2.6 贯叶连翘提取物的生产  57
  4.3 结果与分析  57-61
    4.3.1 性状  57
    4.3.2 辐照杀菌效果  57-58
    4.3.3 微生物的D10 值  58-59
    4.3.4 贮存期间的微生物数量变化  59
    4.3.5 有效成分的含量变化  59-60
    4.3.6 辐照对提取物中金丝桃素和金丝桃苷含量的影响  60-61
  4.4 讨论  61-64
结论  64-66
参考文献  66-72
致谢  72-73
个人简介  73-74
导师简介  74-77

贯叶连翘的固体发酵工艺及电子束辐照研究

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