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稳定高效表达木糖还原酶基因工程酿酒酵母的构建及木糖醇发酵的初步研究

作　者: 李敏
导　师: 鲍晓明
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 木糖还原酶 木糖醇 整合表达 酿酒酵母 工业菌株 发酵
分类号: TS245.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 347次
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内容摘要


木糖醇在食品、医药及化工行业中有着广泛的用途而深受关注。但是，传统的化学法生产木糖醇需要消耗较多的催化剂、化工原料和能源，而且分离纯化较困难，因而成本较高，过高的生产成本限制了木糖醇的应用范围。木糖醇的发酵法生产是一种很有前途的生产方法，发酵工艺生产木糖醇无需木糖的纯化步骤，是取代化学法的一条可行工艺路线。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是公认安全性微生物，但自身不具有代谢木糖的能力。木糖还原酶(xylose reductase)催化木糖为木糖醇的反应，是木糖代谢的第一步。将木糖还原酶的基XYL1引入酿酒酵母中，构建得到高效表XYL1基因的重组酿酒酵母茵株，使其利用木糖转化木糖醇。 本文将树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶基因XYL1连接到适用于酿酒酵母工业菌株的多拷贝整合表达载体pYMIKP中，构建得到表达质粒pYMIKP-XYL1，转化工业酿酒酵母(S．cerevisiae)6508。在含G418的平板上筛选转化子，并通过提高G418浓度增加选择压力和透明圈法筛选的方法进行二次筛选，得到含有多拷贝和低拷贝木糖代谢基因的酿酒酵母重组菌株XGH1、XGH2和XGH3、XGH5。重组菌株在无选择压力培养条件下酶活测定表明，木糖还原酶(XR)在酿酒酵母中得到活性表达，高拷贝重组菌株XGH2和XGH1的木糖还原酶比活力为0.8U／mg和0.5U／mg，比出发菌株分别提高了80倍和50倍以上，表明外源基因在工业菌株中实现了高效表达。 将酿酒酵母重组菌进行摇瓶发酵结果显示，重组菌与宿主菌生长实验表明外源基因的引入对重组菌的生长没有影响。HPLC发酵产物分析表明各重组菌都能利用木糖产生木糖醇。其中，多拷贝整合的酿酒酵母重组菌利用木糖生产木糖醇的效果优于含有低拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌和宿主菌。重组菌株XGH2木糖的消耗为27.9g／L，木糖消耗率为51％：木糖醇产量为30.2g／L，消耗木糖的木糖醇的转化率大于1.0g／g木糖。 通过摇瓶发酵试验，根据对木糖利用影响因素最大的溶氧和温度，进行了不

全文目录


目录  4-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章 绪论  10-23
  1.1 木糖醇的研究背景及其意义  10-11
  1.2 木糖醇的性质  11-15
    1.2.1 木糖醇的理化性质  11-12
    1.2.2 木糖醇的保健功能性  12-14
    1.2.3 木糖醇在食品工业中应用  14-15
    1.2.4 木糖醇的其他作用  15
  1.3 木糖代谢  15-17
    1.3.1 产木糖醇的微生物  15-16
    1.3.2 微生物体内木糖醇合成的调控  16-17
  1.4 酿酒酵母工业菌株的转化体系  17-19
    1.4.1 载体的选择  17-18
    1.4.2 选择标记  18
    1.4.3 转化方法  18-19
  1.5 木糖代谢工业菌株的发酵工艺优化  19-21
  1.6 展望  21-22
  1.7 本文的研究工作  22-23
第二章 木糖醇酿酒酵母工业菌株的构建  23-35
  2.1 导言  23-24
  2.2 材料和方法  24-28
    2.2.1 菌株及质粒  24
    2.2.2 分子克隆用酶和试剂  24
    2.2.3 培养基  24-25
    2.2.4 微生物学技术  25-26
    2.2.5 分子生物学方法  26-28
  2.3 结果与讨论  28-34
    2.3.1 工业酿酒酵母受体菌的选择  28-29
    2.3.2 目的基因的克隆及质粒构建  29-31
    2.3.3 酿酒酵母工业菌株的转化及转化子筛选  31-34
  2.4 小结  34-35
第三章 工业酿酒酵母重组菌株产木糖醇的发酵研究  35-45
  3.1 导言  35
  3.2 材料和方法  35-36
    3.2.1 菌株  35
    3.2.2 培养基  35
    3.2.3 发酵实验  35-36
    3.2.4 发酵生长曲线的测定  36
    3.2.5 发酵产物的分析  36
  3.3 结果与讨论  36-44
    3.3.1 工业酿酒重组酵母菌株XGH2，XGH3木糖醇发酵  36-39
    3.3.2 XGH2木糖醇发酵温度的优化  39-42
    3.3.3 XGH2木糖醇发酵与溶氧量的关系  42-44
  3.4 小结  44-45
全文总结  45-47
  本论文的创新点:  45-46
  今后的工作展望:  46-47
参考文献  47-52
学位论文评阅及答辩情况表  52

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 制糖工业 > 各种糖的生产 > 木糖醇
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