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构建重组大肠杆菌生物合成左旋多巴

作　者: 李伟平
导　师: 李华钟；严群
学　校: 江南大学
专　业: 微生物学
关键词: 酪氨酸酚裂解酶 左旋多巴 重组大肠杆菌 生物合成
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


左旋多巴（3,4-dihydroxyphenyl-l-alanine, L-DOPA）是治疗帕金森氏病的主要药物,在保健美容等领域也具有广阔的应用前景。随着全球人口老龄化的加剧,左旋多巴的需求量也将逐渐提高。与从植物中提取或化学法合成相比,微生物酶法生物合成左旋多巴具有工艺简单、产量稳定等优点。酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol-lyase, TPL）是生物合成左旋多巴的重要酶。该酶可以催化邻苯二酚、丙酮酸钠和氨合成左旋多巴。通过PCR方法扩增得到弗氏柠檬酸细菌（Citrobacter freundii）ATCC 8090中酪氨酸酚裂解酶的结构基因,与带强启动子T5的表达载体pQE30连接后构建重组质粒pQTPL,并将pQTPL转化到E.coli M15中进行表达。经37℃培养2h,在0.2 mmol/L的IPTG存在下,于18℃诱导14h,重组E.coli M15（pQTPL）可合成约占菌体总蛋白61%的可溶性酪氨酸酚裂解酶蛋白,粗酶的TPL比酶活为28.86 U/mg蛋白。E.coliM15（pQTPL）合成L-DOPA能力达到1.61 g/g cell/h。通过单因素和正交优化实验,得到用于培养重组菌E.coli DH5α（pTPL）产酶培养基组成:葡萄糖10 g/L,硫酸铵3 g/L,蛋白胨1 g/L,柠檬酸1 g/L,磷酸二氢钾10 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,TES 5 mL/L;pH为7.0。经优化后,摇瓶培养得到菌体量4.18g/L（DCW）。在3.7 L台式搅拌发酵罐中,控制溶氧在30%以上,初始葡糖糖20g/L,在对数生长期补加10g/L的葡萄糖,培养至7h,菌体生物量为14.34 g/L,TPL活性在8h时达到63.4 U/g cell。通过对重组菌E.coli DH5α（pTPL）生物合成L-DOPA的温度、pH、体系的组成等的研究,得到20mL体系生物合成L-DOPA的工艺条件。体系组分为:初始丙酮酸钠浓度21 g/L,初始邻苯二酚浓度14 g/L,乙酸铵30 g/L,EDTA 1 g/L,Na2SO3 2 g/L,用氨水调节体系pH至8.2,加入15 g/L（干重）的重组菌细胞,转化温度15℃;反应前4h每隔1h、4h后每隔2h补加一次丙酮酸钠和邻苯二酚,分别至9 g/L和6 g/L,至反应12小时后停止补加底物,反应14h后获得L-DOPA最高产量55.2 g/L。以邻苯二酚计的转化率为82.8%。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-8
第一章 绪论  8-13
  1.1 帕金森氏病与L-DOPA  8
  1.2 L-DOPA 生产的国内外研究进展  8-12
    1.2.1 生物合成L-DOPA  8-9
    1.2.2 生物合成L-DOPA 的重要酶-酪氨酸酚裂解酶  9-11
    1.2.3 利用基因工程技术进行L-DOPA 合成的研究  11-12
  1.3 立题背景及意义  12
  1.4 课题研究内容  12-13
第二章 酪氨酸酚裂解酶结构基因的克隆与表达  13-25
  2.1 引言  13
  2.2 材料与方法  13-16
    2.2.1 菌株与质粒  13
    2.2.2 培养基  13
    2.2.3 酶与试剂  13-14
    2.2.4 方法  14-16
  2.3 结果与讨论  16-24
    2.3.1 克隆及重组质粒pQTPL 的构建  16-17
    2.3.2 pQTPL 的酶切鉴定  17
    2.3.3 TPL 基因在E. coli M15 中的表达  17-20
    2.3.4 重组菌的TPL 活性比较  20-21
    2.3.5 重组菌株质粒pQTPL 稳定性  21
    2.3.6 产酶培养基1 中重组E.coli M15(pQTPL)合成L-DOPA 的能力  21-24
  2.4 本章小结  24-25
第三章 重组菌E.COLI DH5Α(PTPL)培养条件优化  25-39
  3.1 引言  25
  3.2 材料与方法  25-26
    3.2.1 菌种  25
    3.2.2 培养基  25
    3.2.3 试剂  25-26
    3.2.4 主要仪器  26
    3.2.5 方法  26
  3.3 结果与讨论  26-38
    3.3.1 乳糖诱导TPL 表达对L-DOPA 合成的影响  26-29
    3.3.2 培养基组分对重组菌生长的影响  29-35
    3.3.3 台式发酵罐中重组菌培养的研究  35-38
  3.4 本章小结  38-39
第四章 生物合成L-DOPA 工艺条件的研究  39-48
  4.1 引言  39
  4.2 材料与方法  39-40
    4.2.1 菌种  39
    4.2.2 培养基  39
    4.2.3 试剂  39
    4.2.4 主要仪器  39-40
    4.2.5 方法  40
  4.3 结果与讨论  40-47
    4.3.1 温度对L-DOPA 合成的影响  40-41
    4.3.2 pH 对L-DOPA 合成的影响  41-42
    4.3.3 铵盐及其浓度对L-DOPA 合成的影响  42
    4.3.4 Na2503 和EDTA 对L-DOPA 合成的影响  42-43
    4.3.5 底物浓度配比对L-DOPA 合成的影响  43-44
    4.3.6 底物起始浓度对L-DOPA 合成的影响  44
    4.3.7 底物补加对L-DOPA 合成的影响  44-45
    4.3.8 L-DOPA 的合成曲线  45-47
  4.4 本章小结  47-48
主要结论  48-49
参考文献  49-52
致谢  52-53
攻读硕士学位期间发表的文章  53

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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