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始旋链霉菌普那霉素生物合成相关基因的克隆、功能和表达研究

作　者: 尹华立
导　师: 金志华
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 始旋链霉菌普那霉素基因中断接合转移生物合成抗性基因
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 46次
引　用: 1次
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内容摘要

普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素类抗生素,由普那霉素Ⅰ和普那霉素Ⅱ两类化合物组成。主要用于治疗由革兰氏阳性菌包括耐药菌引起的感染。抗生素的生物合成由抗性基因、结构基因及调控基因共同协调表达而完成。链霉菌具有复杂的形态分化与次级代谢,其代谢途径是由生物合成酶、一些特异的信号分子和调控蛋白所组成的网络体系,但到目前为止,仅鉴定出17个和普那霉素生物合成相关的基因,所以探寻与普那霉素生物合成相关的新基因有着巨大的空间。根据此目的,利用大肠杆菌与链霉菌接合转移技术而展开了对基因功能研究的系列工作。首先对课题组前期以与普那霉素生物合成密切相关的新基因afsk-like为探针从始旋链霉菌F618基因组文库中筛选得到含有约8kb的DNA片段上的afsk-like全长基因spy1进行基因中断实验研究。从研究结果推断该基因可能与普那霉素ⅠA生物合成正相关,而与普那霉素ⅡA生物合成负相关。由于抗生素的生物合成基因大多是呈簇存在于染色体上,所以接着对筛选到的经测序的8kb的DNA片段进行分析,获得了其上的另外4个可能与普那霉素生物合成相关基因,分别命名为spr1、spr3、spr4、spr5,同时对其进行了基因中断研究。研究结果表明这4个基因可能与普那霉素、普那霉素ⅠA及普那霉素ⅡA均为正相关。最后本文利用与普那霉素生物合成正相关性的抗性基因ptr及链霉菌强启动子ermEp*,通过对其强表达进行了分子育种研究。经过初筛及普那霉素复筛后得到一株普那霉素高产菌株P6-SP,其普那霉素、普那霉素ⅡA及普那霉素ⅠA的产量分别达到335.49mg/L.286.12 mg/L.49.37 mg/L;分别为出发菌株F618的2.29、2.56、1.41倍；并且经传代5次试验表明具有较好的遗传稳定性。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-37
  1.1 普那霉素的概况  13-19
    1.1.1 普那霉素的性质  13-15
    1.1.2 普那霉素的作用机制  15-16
    1.1.3 普那霉素的耐药机制  16
    1.1.4 普那霉素的抗菌活性  16-18
    1.1.5 普那霉素的临床应用  18-19
  1.2 普那霉素生物合成相关基因的概况  19-24
    1.2.1 普那霉素Ⅰ(PⅠ)生物合成  19-21
    1.2.2 普那霉素Ⅱ(PⅡ)的生物合成  21-22
    1.2.3 与普那霉素生物合成相关的调控基因  22
    1.2.4 与普那霉素生物合成相关的抗性基因  22
    1.2.5 与普那霉素生物合成相关基因的分布情况  22-24
  1.3 链霉菌抗生素生物合成相关基因的功能分析  24-27
    1.3.1 单交换  24-25
    1.3.2 交换  25-26
    1.3.3 靶基因内删除  26-27
    1.3.4 基因阻断的载体选择  27
  1.4 链霉菌基因转移的方法  27-31
    1.4.1 原生质体转化(transformation of protoplasts)  28
    1.4.2 电穿孔(electroporation)  28-29
    1.4.3 噬菌体转导(transduction of phage)  29
    1.4.4 接合转移(conjugation)  29-31
  1.5 利用基因工程提高抗生素产量的研究概况  31-35
    1.5.1 链霉菌基因组基本信息及其特点  32
    1.5.2 改造基因簇中调控基因  32-33
    1.5.3 改造抗性基因  33
    1.5.4 利用相关的生物合成基因加速限速反应  33-34
    1.5.5 表达整个生物合成基因簇  34
    1.5.6 改造次生代谢途径  34-35
  1.6 本论文的研究目的和思路  35-37
第二章普那霉素生物合成相关基因spy1的功能研究  37-61
  2.1 引言  37-38
  2.2 材料与方法  38-53
    2.2.1 菌株与质粒  38
    2.2.2 工具酶及试剂盒  38
    2.2.3 抗生素及相关试剂  38-39
    2.2.4 PCR引物  39
    2.2.5 主要的仪器设备  39-40
    2.2.6 培养基  40-41
    2.2.7 溶液的配制  41-43
    2.2.8 实验方法  43-53
  2.3 结果与讨论  53-60
    2.3.1 spy1基因中断载体的构建  53-56
    2.3.2 重组质粒pKC1139::Δspy1通过接合转移导入始旋链霉菌  56-57
    2.3.3 spy1基因中断菌株的筛选  57-58
    2.3.4 spy1基因中断菌株的PCR验证  58
    2.3.5 spy1基因中断菌株的Southern Blotting验证  58-59
    2.3.6 突变菌株发酵产物分析  59-60
  2.4 小结  60-61
第三章普那霉素生物合成相关基因spr1、spr4功能研究  61-74
  3.1 引言  61-62
  3.2 材料与方法  62-63
    3.2.1 菌株与质粒  62
    3.2.2 工具酶及试剂盒  62
    3.2.3 抗生素及相关的试剂  62
    3.2.4 PCR引物  62-63
    3.2.5 仪器设备  63
    3.2.6 培养基  63
    3.2.7 溶液的配制  63
    3.2.8 实验方法  63
  3.3 结果与讨论  63-73
    3.3.1 spr1、spr4基因中断载体构建  63-67
    3.3.2 重组质粒通过接合转移导入始旋链霉菌  67-68
    3.3.3 破坏子的筛选  68-69
    3.3.4 破坏子基因组DNA的PCR验证  69-71
    3.3.5 破坏子基因组DNA的Southern blotting验证  71
    3.3.6 突变菌株发酵产物分析  71-73
  3.4 小结  73-74
第四章普那霉素生物合成相关基因spr3、spr5基因的功能研究  74-85
  4.1 引言  74
  4.2 材料与方法  74-76
    4.2.1 菌株与质粒  74
    4.2.2 具酶及试剂盒  74-75
    4.2.3 抗生素及相关的试剂  75
    4.2.4 PCR引物  75
    4.2.5 仪器设备  75
    4.2.6 培养基  75
    4.2.7 溶液的配制  75
    4.2.8 实验方法  75-76
  4.3 结果与讨论  76-84
    4.3.1 spr3、spr5基因中断载体的构建  76-79
    4.3.2 重组质粒通过接合转移导入始旋链霉菌  79
    4.3.3 破坏子的筛选  79-81
    4.3.4 破坏子基因组DNA的PCR验证  81-82
    4.3.5 破坏子基因组DNA的Southern blotting验证  82-83
    4.3.6 破坏子发酵产物分析  83-84
  4.4 小结  84-85
第五章始旋链霉菌抗性基因ptr的强表达研究  85-93
  5.1 引言  85-86
  5.2 材料与方法  86-87
    5.2.1 菌株与质粒  86
    5.2.2 工具酶及试剂盒  86
    5.2.3 抗生素及相关试剂  86-87
    5.2.4 PCR引物  87
    5.2.5 主要的仪器设备  87
    5.2.6 培养基  87
    5.2.7 溶液的配制  87
    5.2.8 实验方法  87
  5.3 结果与讨论  87-92
    5.3.1 质粒载体pGH112-ermEp~*-ptr的构建及验证  87-90
    5.3.2 质粒载体pSET152-ermEp~*-ptr的构建及验证  90
    5.3.3 含ptr基因接合子的筛选及验证  90-91
    5.3.4 普那霉素高产菌株的筛选  91-92
    5.3.5 高产菌株的遗传稳定性研究  92
  5.4 小结  92-93
第六章总结与展望  93-95
  6.1 研究结论  93
  6.2 研究展望  93-95
参考文献  95-104
攻读硕士学位期间发表论文  104

始旋链霉菌普那霉素生物合成相关基因的克隆、功能和表达研究

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