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芳香聚酮抗生素美达霉素生物合成基因的功能研究

作　者: 蔡晓凤
导　师: 李爱英
学　校: 华中师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 美达霉素生物合成链霉菌基因敲除和回补共表达天然产物分析
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

聚酮抗生素美达霉素（medermycin）具有抗菌和抗肿瘤等生物学活性,其生物合成途径还未阐明。本文利用生物信息学、遗传学和分析化学等手段,就其生物合成基因簇中几个相关基因展开功能分析,内容包括以下几个方面:（1）新型C-糖基转移酶基因:根据同源性分析,推断基因med-ORF8可能负责催化美达霉素的C-C糖苷健的形成（Ichinose K.et al.,2003）。本研究首先使用目前较为常用的PCR介导的链霉菌基因突变系统(Redirect^TM)对med-ORF8进行基因突变分析:完整的美达霉素生物合成基因簇导入一个特殊大肠杆菌细胞,在这个细胞内,定点敲除美达霉素生物合成基因簇中的这个目的基因med-ORF8,获得一个携带有美达霉素突变基因簇的质粒（命名为pHSL3）,将其导入一个常用链霉菌异源表达细胞（Streptomyces coelicolorCH999）中,并进行发酵产物的提取和LC-MS分析。研究发现同野生完整的美达霉素基因簇相比,突变基因簇不能合成美达霉素（初步推断有脱糖基中间产物积累）;然后进行目的基因的互补分析,即构建了一个关于med-ORF8的链霉菌表达质粒pHSL5,导入上面所获得的突变基因簇表达体系中。对基因回补菌株的发酵产物进行分析,发现med-ORF8的导入导致美达霉素又重新产生,说明在美达霉素生物合成途径中,基因med-ORF8确实是个必需基因。（2）糖基合成酶基因:在美达霉素生物合成基因簇中含有6个脱氧六碳糖基合成酶的同源基因,推测负责稀有的脱氧六碳糖胺（安哥拉糖胺）的形成,前期工作中这6个可能参与糖基合成的基因和上面研究的med-ORF8已经克隆在一个表达质粒上（pAYT55）。本研究利用这个多基因共表达体系来验证这些基因的功能,即将这个多基因共表达质粒通过原生质体转化导入一个能产生芳香聚酮kalafungin（推测与med-ORF8的糖基受体结构相似）的链霉菌细胞（Streptomyces coelicolor B135）中,然后对这个体系的代谢产物进行LC/MS分析。结果显示以上这7个基因的共表达质粒在B135中可以导致美达霉素的积累,而仅含这6个糖基合成酶基因的共表达质粒导入B135中,则没有检测到美达霉素的产生。此结果说明在美达霉素生物合成途径中,这6个基因与med-ORF8共同完成了糖基合成和糖基转移的功能。（3）新型转录调控基因:根据同源性分析推断在美达霉素生物合成基因簇中的med-ORF10为一个新型转录调控基因（Taguchi T.et al.,2007）。前期工作中利用Redirect^TM系统已经构建好一个突变基因簇（即在完整美达霉素生物合成基因簇中定向敲除目的基因med-ORF10）。本研究将携带这个突变基因簇的质粒pAYT64通过原生质体转化导入链霉菌的异源表达宿主（Streptomyces coelicolor CH999）中。对获得的菌株的发酵产物进行LC—MS分析。结果显示由于这个基因的敲除导致美达霉素产量急剧减少,同时有中间体积累,说明该基因在美达霉素生物合成中起到正向调控作用。以上这些研究结果为进一步阐明美达霉素的生物合成途径奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章前言  10-26
  1.1 链霉菌与抗生素简介  10-16
    1.1.1 链霉菌概述  10-12
    1.1.2 抗生素简介  12-13
    1.1.3 聚酮抗生素与美达霉素  13-16
  1.2 抗生素糖基化与糖基转移酶  16-18
  1.3 抗生素生物合成的调控  18-20
  1.4 抗生素生物合成中的糖基合成酶基因  20-22
  1.5 抗生素生物合成基因遗传学研究常用技术——基因敲除  22-24
    1.5.1 传统的基因敲除  22-23
    1.5.2 REDIRECT~(TM)系统简介  23-24
  1.6 本项目的研究目的和意义  24-26
第二章材料与方法  26-41
  2.1 菌株  26-27
  2.2 质粒  27-28
  2.3 试剂  28-30
    2.3.1 大肠杆菌质粒提取试剂  28
    2.3.2 链霉菌质粒提取试剂  28
    2.3.3 缓冲液  28-29
    2.3.4 抗生素及其他溶液  29
    2.3.5 酶和生化试剂  29-30
  2.4 培养基  30-33
    2.4.1 液体培养基  30-31
    2.4.2 发酵培养基  31
    2.4.3 固体培养基  31-33
  2.5 实验方法  33-41
    2.5.1 大肠杆菌质粒提取  33-34
    2.5.2 大肠杆菌培养以及常规操作  34-35
    2.5.3 链霉菌培养以及常规操作  35-37
    2.5.4 一般DNA体外操作  37-38
    2.5.5 琼脂糖凝胶电泳  38
    2.5.6 纯化PCR产物  38-39
    2.5.7 链霉菌的发酵产物预处理及检测  39-41
第三章美达霉素生物合成过程中C-糖基转移酶基因med-ORF8的功能初步研究  41-75
  3.1 利用Redirect~(TM)系统进行目的基因敲除分析  41-58
    3.1.1 方案建立:  41-42
    3.1.2 利用Redirect~(TM)敲除目的基因以及功能验证  42-58
  3.2 med-ORF8基因互补体系的建立与产物分析  58-63
    3.2.1 方案建立  58
    3.2.2 基因互补体系建立与产物分析  58-63
  3.3 传统基因敲除突变体系的建立  63-71
  3.4 讨论  71-75
第四章美达霉素生物合成过程中糖基合成酶基因的功能初探  75-83
  4.1 去甲基化糖基合成酶基因和糖基转移酶共表达体系获得  75-78
  4.2 糖基合成酶基因和C-糖基转移酶基因共表达体系转化  78
  4.3 糖基合成酶基因和糖基转移酶共表达体系产物分析  78-79
  4.4 讨论  79-83
第五章美达霉素生物合成过程中新型转录调控基因med-ORF10的功能研究  83-89
  5.1 去甲基化med-ORF10敲除突变体系的获得  84
  5.2 去甲基化med-ORF10敲除突变体系的转化  84-85
  5.3 med-ORF10敲除突变体系的产物分析  85-88
  5.4 讨论  88-89
总结与展望  89-91
参考文献  91-98
硕士期间论文发表  98-99
附录  99-101
致谢  101

芳香聚酮抗生素美达霉素生物合成基因的功能研究

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