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白斑综合症病毒（WSSV）VAP1基因在酵母双杂交系统中的应用及对虾鳃膜蛋白P53的初步研究

作　者: 张莉
导　师: 黄倢；戴继勋
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 白斑综合症病毒 病毒粘附蛋白 酵母双杂交系统 p53鳃膜蛋白 质谱
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 99次
引　用: 2次
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内容摘要


对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对虾暴发性流行病的主要病原,严重危害对虾养殖业。病毒入侵宿主首先要和靶细胞上对应的特异性受体结合,然后在宿主细胞内大量增殖。深入了解WSSV的感染机制,找到编码受体蛋白的基因,无疑对病害的防治具有基础性意义。本实验把病毒粘附蛋白VAP1的基因进行改造后将其应用于酵母双杂交系统Ⅲ,以探索用于筛选与其相互作用的对虾基因的可行性。 VAP1是白斑综合症病毒(WSSV)囊膜上与宿主有结合活性的粘附蛋白之一,已证实它在酵母双杂交系统中作为诱饵蛋白时存在自激活活性。在其C-末端有一个大的跨膜疏水区,拟去除该跨膜疏水区,即把粘附蛋白VAP1的C-末端去除对应的34个氨基酸。在WSSV全基因组中,针对VAP1基因特定位点去除102个bp后,用Primer Premier软件设计了一对引物,并引入Nde Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点,PCR扩增后,酶切、纯化,并定向连接于载体pGBKT7,然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,提取转化菌的质粒后进行PCR以及双酶切鉴定,确定有重组子后进行测序,结果表明序列完全正确。提取重组质粒并分别转化AH109、Y187酵母感受态细胞,选择性培养基鉴定结果表明:表达的诱饵融合蛋白没有激活报告基因HIS3和ADE2,但激活了MEL1。可利用HIS3和ADE2这两种报告基因进行双杂交筛选。 用文库菌株AH109[cDNA Library]和含融合质粒的菌株Y187[pGBKT7-VAP1]做酵母融合,经TDO、QDO缺陷型培养基筛选,并反复划线培养于QDO缺陷型培养基并结合PCR技术确定了一个阳性克隆。对PCR扩增得到的cDNA片段进行测序,其长度为649bp。以+2阅读框分析其核苷酸序列,该序列从终止密码子(TAA)之前即为一个开放阅读框(ORF),这可能即为该段DNA所编码的蛋白。将该cDNA片段于NCBI中经BLASTP同源性比较分析,结果表明其表达的蛋白与一未命名蛋白产物(Unnamed protein product)的同源性最高为59%,与蛋白酶的同源性为38%,与Cell wall mannoprotein,acceptor of B1-6 glucan的同源性为26%。从病毒与鳃膜蛋白的特异性结合推测该蛋白很可能是一种蛋白酶,它与病毒粘附蛋白的结合类似于酶与底物的结合,具有高度的专一

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章 文献综述  12-37
  第一节 可应用于病毒受体研究的几种生物技术途径  12-24
    1 噬菌体表面展示技术(Phage surface display techniques，PSDT)  13-14
    2 病毒铺覆蛋白印迹技术(Virus overlay protein blot assay，VOPBA)  14-15
    3 层析法(Chromatography)  15-16
    4 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)  16-17
    5 单克隆抗体技术(Monoclonal antibody technique)  17-18
    6 受体基因的克隆及表达  18-24
  第二节 酵母双杂交系统的研究进展  24-37
    1 酵母双杂交系统的基本原理  25-26
    2 酵母双杂交技术的应用研究现状及其局限性  26-28
    3 酵母双杂交系统的改进与发展  28-37
第二章 VAP1基因的改造与pGBKT7-VAP1诱饵重组质粒的构建  37-71
  第一节 VAP1基因的改造  37-39
    1.材料与方法  37-39
      1.1 VAP1的功能与基因改造的原因  37-38
      1.2 改造后的VAP1及分析  38-39
  第二节 VAP1基因的克隆  39-50
    1.材料与方法  39-43
      1.1 引物设计  39
      1.2 WSSV DNA模板的提取  39-41
      1.3 PCR扩增目的片段  41-42
      1.4 PCR产物的检测与定量  42
      1.5 PCR产物的纯化与定量  42-43
    2.结果与分析  43-48
      2.1 WSSV病毒的提纯  43-44
      2.2 引物设计结果  44-47
      2.3 扩增结果  47-48
    3.讨论  48-50
  第三节 pGBKT7-VAP1诱饵重组质粒的构建与扩增  50-57
    1.材料与方法  50-54
      1.1 材料、试剂与培养基  50
      1.2 VAP1 PCR产物的酶切  50-51
      1.3 酶切产物的纯化定量  51
      1.4 pGBKT7载体质粒的构造、双酶切、纯化与定量  51
      1.5 VAP1与线性载体pGBKT7的连接  51-52
      1.6 重组载体pGBKT7 DNA-BD／VAP1的转化、双酶切及PCR鉴定  52-54
    2.结果与分析  54-56
      2.1 pGBKT7-VAP1重组质粒的转化效率、提取及双酶切鉴定  54-55
      2.2 pGBKT7-VAP1的PCR鉴定  55
      2.3 插入片段的测序与分析  55-56
    3.讨论  56-57
  第四节 pGBKT7-VAP1的酵母转化与自激活作用检测  57-71
    1.材料与方法  57-65
      1.1 酵母双杂交的实验流程  57
      1.2 GAL4系统所用酵母菌株与载体  57-62
      1.3 重组质粒pGBKT7-VAP1转化酵母菌AH109和Y187  62-64
      1.4 自激活作用检测  64-65
      1.5 诱饵融合蛋白毒性检测  65
    2.结果  65-69
      2.1 酵母重组质粒的提取  65
      2.2 重组质粒转化酵母细胞的PCR鉴定  65-66
      2.3 转化效率  66
      2.4 诱饵融合蛋白自激活作用检测  66-68
      2.5 融合蛋白毒性检测  68-69
    3.讨论  69-71
第三章 AH109[cDNA Library]与Y187[pGBKT7-VAP1]的酵母融合与阳性克隆的确定  71-85
  第一节 AH109[cDNA]与Y187[pGBKT7-VAP1]的融合与选择性培养  71-78
    1.材料与方法  71-74
      1.1 缺陷性培养基的配制  71
      1.2 试剂、材料与仪器  71
      1.3 AH109[cDNA Library]与Y187[pGBKT7-VAP1]的酵母融合  71-72
      1.4 阳性克隆的鉴定  72-74
      1.5 酵母融合对照组情况  74
    2.结果  74-76
      2.1 融合过程观察  74-75
      2.2 融合效率  75
      2.3 PCR扩增cDNA片段  75-76
      2.4 融合酵母对照组情况  76
    3.讨论  76-78
  第二节 阳性克隆的序列测定与分析  78-85
    1.材料与方法  78
      1.1 cDNA插入片段的序列测定  78
      1.2 cDNA插入片段的生物信息学分析  78
    2.结果  78-83
      2.1 cDNA插入片段的测序结果  78
      2.2 cDNA插入片段的序列分析  78-83
    3.讨论  83-85
第四章 对虾鳃膜蛋白的研究  85-102
  第一节 凡纳滨对虾鳃细胞膜的提取与膜蛋白的增溶  85-89
    1.材料与方法  85-87
      1.1 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜的提取  85
      1.2 鳃细胞膜的DIG标记  85-86
      1.3 DIG标记鳃细胞膜的增溶  86
      1.4 ELISA检测结合活性  86-87
    2.结果  87-88
      2.1 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜的提取  87-88
      2.2 两种增溶剂对膜蛋白与WSSV结合活性的影响  88
    3 讨论  88-89
  第二节 P53鳃膜蛋白的测序  89-102
    2.1 鳃膜蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳  89
    2.2 P53鳃膜蛋白的MODLI-TOF-MS-MS测序  89-90
    2.3 鳃膜蛋白的阿尔新蓝(Alcian Blue)染色法(检测糖蛋白)  90
    2.结果  90-100
      2.1 鳃膜蛋白的SDS-PAGE  90
      2.2 P53鳃膜蛋白测序结果  90-100
      2.3 鳃膜蛋白中糖蛋白的确定  100
    3.讨论  100-102
附录  102-107
  (一).Cutted-VAP1基因克隆序列测序图  102-103
  (二) 筛选的基因序列测序图  103-104
  (三).主要培养基及试剂配方  104-107
致谢  107

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
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