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组织和发育特异性表达抗病双基因转化甘蓝型油菜及其抗病性研究

作　者: 徐光硕
导　师: 孟金陵
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甘蓝型油菜(Brassica napus) in planta 抗衰老草酸氧化酶基因(Oxalic Oxidase) 几丁质酶基因(Chitinase) PSAG12 菌核病
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

菌核病是油菜的主要病害，该病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的子囊孢子直接侵染衰老的叶片，或先侵染飘落在衰老叶片上的花瓣后，再产生菌丝侵入叶片和植株本体。几丁质是核盘菌菌丝体细胞壁的主要组成成分。几丁质酶破坏真菌菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病菌的生长。草酸是核盘菌侵染寄主植物后分泌的毒素。草酸氧化酶分解草酸，缓解核盘菌在油菜体内的毒性。将这两种抗病性机理十分不同的基因构建在一起，期望创造出高抗菌核病的转基因甘蓝型油菜植株。另外，将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因与拟南芥衰老叶片启动子、P_SAG12相嵌合，使两外源基因将仅在油菜的衰老叶片中表达。这不仅大大增强了油菜的抗病性，减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱，还将使转基因作物更加安全可靠。另外，由于在进化上花瓣是叶片演化而来，是叶的变态，上述基因还可能在P_SAG12的启动下在花瓣中尤其是将飘落的花瓣中特异性表达，使核盘菌难以侵染花瓣，从而减轻核盘菌对植株的再侵染。实验采用了in planta转化方法，将外源基因导入中油821、宁RS-1、湘油13三种甘蓝型油菜品种中，对转基因植株T₀代和T₁代进行了PCR，Southern blot，RT-PCR检测证实了外外源基因已经导入并表达。通过离体叶片接种和草酸毒素法鉴定转基因植株对菌核病的抗（耐）性。实验的主要结果如下： 2 构建了植物表达载体ApSCO(LB-P_SAG12-pr16-chil3b-tnos-P_SAG12-oxo-tnos-pnos-nptⅡ-tnos-RB) 2．应用in planta转化方法，将质粒ApSCO转化中油821、宁RS-1、湘油13和华双3号四种甘蓝型油菜品种，除华双3号由于收获种子较少未获得PCR阳性植株外，其余3个品种均获得了转基因植株转化效率在0.1％左右。各甘蓝型油菜品种间的转化效率无明显差异。这种方法方便、快速且无须经过组织培养阶段即可获得上百株转基因植株。该方法的成功为建立更高效的甘蓝型油菜转基因方法以及开展甘蓝型油菜的功能基因组研究打下了基础。 3．PCR和Southern-blot检测证明外源基因已经导入甘蓝型油菜并整合于油菜的染色体中。 4．离体叶片接种结果：转基因植株T1代19个株系的病情指数小于70％，转基因植株各株系的平均病斑直径最小的Nl为1.犯切.345cm比对照小1 .25cm。5.不同时期离体叶片接种结果:衰老叶片比幼嫩叶片接种后的病斑扩展速率平均小0.93cm，扩展速率差值最大的210一巧为l.33cm。衰老叶片比幼嫩叶片接种后的病斑直径平均小0.64cm，病斑直径差值最大的Nl一7为o.96cm。这表明外援基因确实在转基因植株的衰老叶片中表达了，并且在衰老叶片中的表达量高于在幼嫩叶片中的表达量，表现为表达的发育特异性。6.对X12转基因植株Tl代进行了PCR扩增，经卡方检测证明，阳性和阴性比为3:说明外源基因己经遗传给后代，并符合孟德尔遗传规律。7.草酸毒素法检测结果与离体叶片接种结果成正相关，转基因植株Tl代19个株系的毒素指数小于60%。由于草酸毒素法对叶片的病害比离体叶片接种小，所以草酸毒素法所得毒素指数均比离体叶片接种所得病情指数偏小。该检测结果表明，外源草酸氧化酶基因的表达对植株的抗病性起到作用。8.离体花瓣接种结果表明:花瓣接种病斑直径与叶片接种病斑直径之间表现为一定的相关性，这说明可能外源基因在叶的变态—花瓣中得到了表达。9.RT-PCR结果也表明转基因植株衰老叶片中草酸氧化酶和几丁质酶的表达量比幼嫩叶片中高，比未转基因植株衰老叶片高很多。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
前言  8-17
  1 遗传转化研究进展  8-12
    1.1 植物遗传转化研究概况  8
    1.2 植物转基因技术的发展与现状  8-9
    1.3 植物转基因方法  9-12
      1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化  9-10
      1.3.2 外源基因直接导入法  10-11
      1.3.3 种质系统的遗传转化  11-12
  2 遗传转化在油菜上的应用  12-14
    2.1 转基因与油菜抗性  12-13
      2.1.1 抗真菌病和抗病毒病  12-13
      2.1.2 抗虫  13
      2.1.3 抗除草剂  13
    2.2 通过转基因改善油菜品质  13-14
  3 本课题提出的目的和意义  14-17
    3.1 几丁质酶  14-15
    3.2 草酸氧化酶  15
    3.3 油菜菌核病  15-16
    3.4 抗衰老启动子  16
    3.5 本课题的研究内容  16-17
材料与方法  17-26
  1 实验材料  17-18
    1.1 植物材料  17
    1.2 根癌农杆菌菌株及相关质粒  17
    1.3 病原菌  17-18
    1.4 试剂及仪器  18
  2 实验方法  18-26
    2.1 组织发育特异性表达抗病双基因载体的构建  18
      2.1.1 培养基和培养条件  18
      2.1.2 质粒DNA的分离与操作  18
    2.2 转基因方法  18-19
      2.2.1 根癌农杆菌的培养  18
      2.2.2 根癌农杆菌浸染油菜花序  18-19
      2.2.3 种子的收获  19
    2.3 转基因后代的鉴定  19-25
      2.3.1 转基因植株的卡那霉素抗性筛选  19
      2.3.2 转基因植株的PCR检测  19-20
      2.3.3 Southern blot分析  20-22
      2.3.4 反转录PCR(RT-PCR)  22-24
      2.3.5 转基因植株的抗性鉴定  24-25
        2.3.5.1 核盘菌的培养  24
        2.3.5.2 离体叶片接种鉴定  24
        2.3.5.3 离体花瓣接种鉴定  24-25
        2.3.5.4 离体叶片草酸抗性鉴定  25
    2.4 转基因植株的命名  25-26
结果与分析  26-40
  1 组织发育特异性表达双基因载体ApSCO的获得  26-27
    1.1 含SAG12启动子、几丁质酶和细胞膜引导肽的中间载体的构建  26
    1.2 含草酸氧化酶的中间载体的构建  26
    1.3 组织和发育特异性表达双基因载体的构建  26-27
  2 以in planta方法转化甘蓝型油菜  27
  3 卡那霉素筛选in planta种子  27-29
  4 转基因植株的PCR检测分析  29-30
  5 in planta方法的转化效率  30
  6 离体叶片接种及鉴定结果  30-32
  7 离体叶片草酸抗性检测及分析  32-34
  8 转基因植株离体叶片接种与草酸抗性分析得出的两种病情指数比较  34-35
  9 转基因植株离体衰老叶片与幼嫩叶片接种比较  35-36
  10 离体花瓣接种鉴定及结果  36-37
  11 Southern检测结果  37-38
  12 RT-PCR检测结果  38-40
讨论  40-45
  1 抗衰老启动子pSAG12在油菜抗病中的应用  40-41
  2 SAG12的表达模式与抗病的关系  41
  3 花瓣的衰老与油菜抗病的关系  41
  4 In planta转化方法在甘蓝型油菜中的应用  41-43
    4.1 In planta转化中转化子的筛选体系  41-42
    4.2 影响幼苗萌发的条件  42
    4.3 In planta转化方法的应用前景  42-43
  5 双基因共转化可进一步提高转基因油菜对菌核病的抗性  43-44
  6 转基因植物中卡那霉素(Kan~r)标记基因的生物安全性  44-45
附录  45-48
  附录1 MS培养基成分  45
  附录2 LB液体培养基  45
  附录3 PDA土豆培养基  45
  附录4 DNA微量提取程序  45-48
参考文献  48-52
致谢  52

组织和发育特异性表达抗病双基因转化甘蓝型油菜及其抗病性研究

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