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人宫颈癌基因（HCCR）对胰腺癌PANC1细胞肿瘤生物学行为的影响及其上游信号调控机制研究

作　者: 蒋佳凯
导　师: 徐泽宽
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胰腺癌 HCCR PANC1 siRNA 蛋白激酶B
分类号: R735.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:建立稳定转染人宫颈癌基因(Human Cervical Cancer Oncogene,简称HCCR)siRNA真核表达质粒的人胰腺癌PANC1细胞株,研究siRNA干扰HCCR的表达后对人胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。探讨PI3K/Akt信号转导通路调控HCCR表达的分子机制。方法:1、构建包含HCCRsiRNA的真核表达质粒pGCsi-HCCR,通过脂质体转染法将真核表达质粒pGCsi-HCCR稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1,抗生素G418筛选2-3周后克隆环挑取稳转细胞株,经western blot反复鉴定,获得生物学特性稳定的HCCRsiRNA的PANC1细胞株和空载体PANC1细胞株。2、Western blot检测siRNA干扰组和对照组(即空载体组)的PANC1细胞中HCCR的蛋白表达情况,同时检测肿瘤相关基因p53蛋白表达的情况。3、流式细胞仪检测siRNA干扰组和对照组的PANC1细胞的细胞周期和凋亡率变化。MTT比色法检测siRNA干扰组和对照组的PANC1细胞增殖能力的变化。Transwell侵袭实验观察siRNA干扰对PANC1细胞侵袭能力的影响。4、培养并鉴定稳定转染活化型及缺陷型Akt的PANC1细胞株,用含HCCR不同启动子片段的荧光素酶报告基因质粒转染该两株细胞,检测荧光活性,从而研究活化型及缺陷型Akt对HCCR启动子区域的作用及结合位点。结果:1、获得稳定转染HCCRsiRNA干扰组和对照组的PANC1细胞株抗生素筛选获得的HCCRsiRNA稳转组1和稳转组2与两株空载体组PANC1细胞单克隆培养后在荧光显微镜下全视野均呈现绿色荧光,为真核载体上的GFP基因表达的绿色荧光蛋白,表明成功稳转。western blot结果显示上述两株HCCRsiRNA稳转组细胞与两株对照组PANC1细胞相比,HCCR蛋白表达水平明显下降,HCCRsiRNA干扰组和对照组的PANC1细胞株成功获得。2、siRNA干扰组和对照组的PANC1细胞的P53蛋白表达Western blot检测siRNA干扰后P53蛋白表达的变化,结果显示HCCRsiRNA稳转组1和HCCRsiRNA稳转组2细胞p53蛋白表达水平均低于对照组。3、siRNA干扰组和对照组的PANC1细胞的细胞周期和凋亡率、增殖、侵袭情况。流式细胞仪检测结果显示siRNA稳转组1、siRNA稳转组2与空载体组相比,G0/G1期细胞比率上升,S期细胞比率下降。转染HCCRsiRNA后,PANC1细胞凋亡指数有所增加,差异有统计学意义。MTT增殖实验结果显示siRNA稳转组和对照组相比,各个时间点细胞增殖能力都受到明显抑制,第四天两株转染组细胞吸光度值分别为空载体对照组的0.65倍和0.68倍,差异有统计学意义。Transwell侵袭实验显示siRNA稳转组和空载体组穿膜细胞数分别为24.38±9.94和49.13±15.37, siRNA稳转组细胞侵袭能力较空载体组明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。4、三个HCCR启动子片段pGL3-P1196, pGL3-P504, pGL3-P423,在活化性Akt的PANC1细胞转染子中的荧光素活性分别是对照组的1.53、1.80、1.50倍。在缺陷型Akt转染子中的荧光素活性分别是对照组的0.76、0.75、1.0倍。HCCR启动子区域能够被活化性Akt激活,但不能被缺陷型Akt所激活。结论:1、通过siRNA干扰HCCR的表达后能抑制胰腺癌PANC1细胞增殖和侵袭,促进其凋亡。2、HCCR启动子区域能够被活化性Akt激活,但不能被缺陷型Akt所激活。HCCR可能通过PI3K/Akt信号转导通路来调节胰腺癌细胞的发生发展。

全文目录


一、中文摘要  4-7
二、英文摘要  7-9
人宫颈癌基因（HCCR）对胰腺癌PANC1细胞肿瘤生物学行为的影响及其上游信号调控机制研究  9-29
  前言  9-11
  材料和方法  11-18
  结果  18-24
  讨论  24-28
  小结  28-29
四、参考文献  29-33
五、综述  33-53
  综述一  33-41
    参考文献  38-41
  综述二  41-53
    参考文献  47-53
六、在读期间发表论文  53-54
七、致谢  54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胰腺肿瘤
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