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幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆、表达及其在血清学诊断中的应用

作　者: 徐俊荣
导　师: 张沥；闫小君
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学（消化内科学）
关键词: 幽门螺杆菌尿素酶C基因大肠杆菌免疫球蛋白G 斑点金免疫渗滤实验
分类号: R570.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

幽门螺杆菌（Hp）是一种在胃病患者胃内发现的革兰阴性弯曲杆菌。Hp是急慢性胃炎及胃十二指肠溃疡的致病因素。它与胃癌及胃粘膜相关性淋巴组织（MALT）淋巴瘤的关系也十分密切。Hp最为重要的特征是含有极为丰富的尿素酶。此酶可以迅速将尿素分解为氨和二氧化碳。在Hp定植及引起胃粘膜损伤的过程中起重要作用。目前发现Hp尿素酶基因大小约为7.5Kb，共有9个阅读框（ORF），分别为ureC、ureD、ureA、ureB、uxeI、ureE、ureF、ureG和ureH。其中ureA、ureB为尿素酶的两个结构基因，它们具有高度保守性，是PCR检测Hp感染常选择的目的基因。ureA、ureB具有免疫原性，已被应用于Hp疫苗的研究中。其余7个ORF为尿素酶的辅助基因。其中ureI和ureH为Hp所特有。ureC基因相对保守，常被用于PCR检测Hp感染的靶基因。现在已开发出的三种DNA酶免疫鉴定法检测Hp感染的试剂盒，也都是根据Hp ureC基因设计探针来检测Hp感染的，这说明Hp ureC在诊断Hp感染中的价值已得到认可。幽门螺杆菌（Hp）感染的诊断方法有多种，但主要分为侵入性和非侵入性两大类。前者包括细菌学检查技术和尿素酶试验，需要内镜取材；后者包第四军医大学硕士学位论文一括呼气实验和血清学检查，不需要内镜取材。其中血清学诊断最为简便，在Hp感染的人群筛检和流行病学调查中有极为重要的意义。目前ELISA方法仍是最常用的检测即的血清学方法。此方法敏感性和特异性均较高，但需要特殊培训的技术人员及检测OD值的酶标仪，且费时太久，限制了这种方法的应用。DIFGA是基于胶体金标记枝术的一种快速斑点免疫结合试验。该方法使用微孔滤膜为载体，利用其渗滤浓缩及毛细管作用使抗原抗体反应快速进行。与 ELISA相比，它具有快速、简便的优点。敏感性与特异性几乎与之相当。为了表达 Hp ureC重组基＠，本研究根据发表的地序列设计了一对引物，应用 PCR技术从 Hp基困组 DNA中扩增得到了 11 79hp的 ureC基固片段，经 BamH和 EcoR双酶切后将其克隆到大肠杆菌克隆载体帅删上Zf（刁上，经测序证实为ureC基固。将ureC基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pBV220中，42C温度诱导表达T 44KDa的重组蛋白，表达量占菌体总蛋白的24．8％，其分子量与预期的一致。表达产物主要以包涵体形式存在，但裂解上清中仍有少量重组蛋白。经间接 ELISA和 Western Blot分析，证实表达的ureC蛋白具有良好的抗原性。应用高效液相色谱枝术，本实验对ureC重组蛋白进行了初步的分离和纯化。将纯化的ec重组蛋白用做斑点金免疫渗滤试验中的抗原，与福建三强公司的斑点金法检测 Hp urease IgG的试剂盒对比检测了97份消化科l门诊病人血清。结果显示两者的总符合率为94．8％，经X‘检验两方法无显著差异。若以三强公司的斑点金试剂盒为标准，我们建立的 DIFGA方法的敏感性和特异性分别为 96．l0和 90．0O。经重复性试验证明其有良好的准确性。为了验证 ureC重组蛋白的免疫原性，我们用新西兰纯种兔进行了免疫动物实验，获得了高效价的抗 Hp ureC抗体，证实了 ureC重组蛋白有良好的兔疫原性。以上实验结果证明，Hp尿素酶ureC基因在大肠杆菌中得到了较好的表达。用纯化的重组尿素酶C蛋白作为抗原而建立的DIFGA方法用于检测抗Hp尿素酶IgG抗体是可行的，有一定的临床应用价值。

全文目录

英文缩写词表  3-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-12
文献回顾  12-22
  幽门螺杆菌尿素酶的研究进展  12-16
  幽门螺杆菌诊断方法的研究进展  16-22
材料与方法  22-35
  实验材料  22-24
  实验方法  24-35
结果  35-47
讨论  47-52
小结  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-60

幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆、表达及其在血清学诊断中的应用

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